שיטות מיקרוסקופית הקרינה לקביעת הכדאיות של חיידקים באיגוד עם תאי יונקים
Summary
מרכזי בתחום הפתוגנזה חיידקים הוא היכולת להגדיר אם וכיצד חיידקים לשרוד לאחר חשיפה לתאי אוקריוטים. מאמר זה מתאר פרוטוקולים לשימוש בצבעי ניאון החושפים את יכולת הקיום של חיידקים בודדים בפנים וקשור עם תאי מארח.
Abstract
מרכזי בתחום הפתוגנזה חיידקים הוא היכולת להגדיר אם וכיצד חיידקים לשרוד לאחר חשיפה לתאי אוקריוטים. פרוטוקולים הנוכחיים כדי לענות על שאלות אלה כוללים מבחני ספירת מושבה, מבחני הגנת גנטמיצין, ומיקרוסקופ אלקטרונים. מבחני ספירת מושבה והגנת גנטמיצין רק להעריך את הכדאיות של אוכלוסיית החיידקים כולה ואינם מסוגלים לקבוע כדאיות חיידקים בודדות. במיקרוסקופ אלקטרונים ניתן להשתמש כדי לקבוע את הכדאיות של חיידקים בודדים ולספק מידע לגבי הלוקליזציה שלהם בתאי מארח. עם זאת, לעתים קרובות חיידקים להציג מגוון רחב של צפיפויות אלקטרונים, ביצוע הערכה של יכולת קיום קשה. מאמר זה מתאר פרוטוקולים לשימוש בצבעי ניאון החושפים את יכולת הקיום של חיידקים בודדים בפנים וקשור עם תאי מארח. מבחני אלו פותחו במקור כדי להעריך הישרדות של Neisseria gonorrhoeae בנויטרופילים אנושיים ראשוניים, אבל צריך להיותpplicable לכל אינטראקציה תא חיידק מארח. פרוטוקולים אלה משלבים צבעי קרום חדיר ניאון (SYTO9 ו4 ',6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), שמכתים את כל חיידקים, עם צבעי קרום בלתי חדיר ניאון (יודיד propidium וSytox ירוק), שהם נגישים רק ל חיידקי nonviable. לפני permeabilization תא אוקריוטים, נוגדן או מגיב ניאון מתווסף לזהות חיידקים תאיים. לכן מבחני אלה מפלים את הכדאיות של חיידקים חסידים ולבתוך תאי אוקריוטים. פרוטוקול הוא גם סיפק לשימוש בצבעי הכדאיות בשילוב עם נוגדני ניאון לסמני תא אוקריוטים, על מנת לקבוע את לוקליזציה subcellular של חיידקים בודדים. צבעי כדאיות החיידקים שנדונו במאמר זה הם מוצר משלים רגיש ו / או תחליף לטכניקות מיקרוביולוגיה מסורתיות כדי להעריך את הכדאיות של חיידקים בודדים ולספק מידע בדבר שבו חיידקים לשרוד בתא מארחs.
Introduction
יש אינטראקציה דינמית ואבולוציה משותפת בין חיידקים והמארחים שבו הם מתגוררים. חיידקים התפתחו האברונים דבקות, מערכות הפרשה, ו / או את היכולת לייצר רעלים המאפשרים זיהום הפורה של phagocytic המארח ותאים שאינם phagocytic. החיידקים חייבים גם להתמודד עם הכרה ופעילות מיקרוביאלית של מערכת החיסון המארחת. המערכת החיסונית של המארח מורכבת ממרכיבים מולדים ובעלי כושר הסתגלות, כולל מחסומים פיסיקליים וכימיים, תאי מערכת החיסון, מערכת המשלימה, ורכיבים אחרים של חסינות הלחות. בעוד חיידקים רבים רגישים להרג ולאישור על ידי התגובה חיסונית מארח רב שכבתית, כמה חיידקים פתוגניים ואופורטוניסטיים התפתחו מנגנונים להדביק מגוון רחב של תאי מארח ולחתור תחת אישור על ידי התגובה חיסונית מארח 1. Neisseria gonorrhoeae הוא דוגמא אחת לפתוגן חיידקים כי הוא מותאם מאוד להתמיד במארח האנושי שלה. N. gonorrhoeae קלות colonizes משטחי luminal של תאי האפיתל ברירית של דרכי השתן ואברי המין, לוע, לחמית, ופי טבעת. קולוניזציה מעוררת את גיוס שפע של נויטרופילים באתרים ברירית. הנויטרופילים הם phagocytes המקצועי שיש להם מגוון רחב של תהליכים מיקרוביאלית להרוג מיקרואורגניזמים, עם זאת, נ ' gonorrhoeae הוא מסוגל לשרוד בנוכחות של נויטרופילים 2-5. הבנה כיצד חיידקים פתוגנים, כגון נ gonorrhoeae לערער, לדכא, ולחטוף את התגובה החיסונית כדי לשרוד סופו של דבר בסביבות מארח בדרך כלל עוינות הוא קריטי לפיתוח של טיפולים חדשים למאבק במחלות זיהומיות.
פרוטוקולי ניסוי משמשים לעתים קרובות כדי לחקור הישרדות חיידקים בתאי מארח כוללים מבחני ספירת מושבה, מבחני הגנת גנטמיצין, ומיקרוסקופ אלקטרונים. במבחני ספירת מושבה, אוכלוסייה של תאים נגועים lysed (למשל, עם חומר ניקוי ל"שich החיידקים עמידים) כדי לשחרר את החיידקים. Lysates הוא בדילול ומצופה על תקשורת מבוססת אגר, ומושבת יוצרי יחידות בlysates ממוספרת עבור כל נקודת זמן ו / או תנאי ניסוי. גישה זו מדווחת על יכולת הקיום של אוכלוסיית החיידקים כולה, אבל הוא לא מסוגל להבדיל בין תאיים והישרדות תאית. וריאציה על assay ספירת מושבה, assay הגנת גנטמיצין, במיוחד מודדת הישרדות חיידקים תאית, המבוסס על חוסר היכולת של גנטמיצין האנטיביוטיקה לחצות את קרום הפלזמה אוקריוטים 6. עם זאת, assay זה תלוי בחיידקים שרגישים להרג על ידי גנטמיצין (אנטיביוטי או אחר, כי הוא קרום impermeant דומה אוקריוטים) וחוסר היכולת של האנטיביוטיקה כדי לקבל גישה לחיידקים פנימיים. לכן, assay הגנת גנטמיצין לא יכול להיות יעיל לבדיקה של כל מיני החיידקים או כאשר בוחנים את הישרדות חיידקים במאודתאי pinocytic כגון נויטרופילים. אף אחת מהגישות הללו חושף את לוקליזציה subcellular או התנהגות של חיידקים בודדים אחרת (למשל, אם החיידקים ליצור אגרגטים או microcolonies שמתנהג בצורה שונה מתאי חיידקים בודדים). גישה בשימוש תכופה נוספת כדי לבחון את הכדאיות של חיידקים חיצוניים ופנימיים בודדים היא מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים דק סעיף (TEM). גישה זו יש יתרון בכך שהוא יכול לספק מידע לגבי מיקומם של החיידקים בתאי מארח (למשל phagosome, ציטופלסמה, autophagosome), אשר יכול להיחקר יותר על ידי מיקרוסקופ immunoelectron עם נוגדני מצמידים זהב נגד סמני subcellular. עם זאת, במיקרוסקופ אלקטרונים אינו רגיש במיוחד בהערכת כדאיות חיידקים. כאשר חלקים מוטבעים מגואלות אצטט uranyl, ציטראט עופרת, או חומרים כימיים אלקטרונים צפופים אחרים וצלמו על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים, חיידקי אלקטרונים צפופים נחשבים קיימא וelecטרון-Lucent 7,8 nonviable. עם זאת, הנחה זו מגזים בהערכת כדאיות חיידקים, שכן חיידקים מתים האלה רק עם קרומים ונטולי ציטופלסמה שיבשו קשות מופיעה אלקטרונים לוסנט. בנוסף, חלק ממיני חיידקים עשויים להציג מגוון של צפיפויות אלקטרונים בהתאם לשלב צמיחה שלהם, ולכן קשה לקבוע כדאיות.
כחלופה או בנוסף לשיטות בשימוש נרחבת אלה, כאן אנו מספקים פרוטוקולים ורציונל לשימוש בצבעי ניאון שמצביעים על כדאיות בקטריאלי על מנת להעריך את ההישרדות של חיידקים מצורפים והפנימו על ידי תאי מארח. כדי לזהות חיידקים תאיים, תאים נגועים נחשפים ראשון למגיב ניאון, כגון קטינים או נוגדני חיידק ספציפי. לאחר מכן התאים הנגועים permeabilized ונחשפו לצבעי DNA ספציפי שהם באופן דיפרנציאלי נגישים לחיידקים עם שלם לעומת ממברנות מושפלים, כתחליף ליכולת קיום חיידקים. בעמ 'הראשונהrotocol, SYTO9 הצבע החדיר הקרום מזהה את אוכלוסיית חיידקים בסך הכל, בעוד יודיד propidium נגיש רק לאלה חיידקים שהתפשרו ממברנות ולכן הן נחשבות nonviable. Propidium יודיד וSYTO9 כבר משמשים להערכת כדאיות חיידקים בbiofilms, להפלות פתוגניים מחיידקי nonpathogenic, ולמנות את החיידקים שמקורן במי קיימא 9-12. בפרוטוקול השני, 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) מזהה חיידקי סך הכל, בעוד Sytox הירוק הוא נגיש רק לאוכלוסיית nonviable. ניתן לשלב זוגות צבע כדאיות אלה עם immunofluorescence כדי לקבוע את המיקום של כל חיידק ביחס לחלבון של עניין, למשל להגדרת לוקליזציה subcellular חיידקים. השימוש במבחנים אלה מספק תובנה מפתח לתוך האינטראקציות שתגרומנה להרג או להישרדות חיידקים במהלך ההדבקה של תאי מארח. הפרוטוקולים שתוארו במאמר זה שימשו להערכת הכדאיות שלנ gonorrhoeae המחובר ולבתוך נויטרופילים אנושיים ראשוניים, ובכלל זה באוכלוסיות שונות של phagosomes נויטרופילים 5,13,14. עם זאת, יכולים להיות מיושמים על פרוטוקולים אלה כדי להעריך את הכדאיות של חיידקי גרם חיוביים וגרמו שליליים בphagocytes המקצועי, phagocytes הלא מקצועי, ופרוטוזואה 15-24.
Protocol
Representative Results
Discussion
מוצגים כאן הם שני פרוטוקולים המשתמשים DNA מחייב וצבעי כדאיות בשיתוף עם קטיני ניאון כדי לזהות חיידקים חיים ומתים מצורפים ובתוך תאים אנושיים. מכיוון ששני הפרוטוקולים ביעילות להפלות חיים מחיידקים מתים, הבחירה באיזה פרוטוקול של להשתמש תלויה במטרה הניסוי. הפרוטוקול הראש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לאסיה סמירנוב ולורה Gonyar לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH r00 TW008042 וR01 AI097312 לAKCMBJ נתמכים בחלקו על ידי NIH T32 AI007046.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 3/4 butterfly needles for blood collection | Becton Dickinson | 367251 | |
| Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml | Becton Dickinson | 366480 | |
| Sterile water for irrigation | Baxter | 07-09-64-070 | |
| Dextran 500 | Sigma | 31392 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S641 | |
| Dextrose | Ricca Chemical Company | RDCD0200 | |
| Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+ | Thermo Scientific | SH3002802 | |
| Ficoll solution | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401 | |
| 12 mm circular glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| 24-well plates | Corning Incorporated | 3524 | |
| Pooled Human Serum | Sigma | S7023 | |
| RPMI | Mediatech | 15-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007103 | |
| Human interleukin-8 | R&D Systems | 208-IL/CF | |
| MOPS | Sigma | M3183 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214 | |
| Propidium Iodide | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| SYTO9 | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| Saponin | Fluka Analytical | 47036 | |
| Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin | Life Technologies | L-32463 | |
| DAPI | Sigma | D8417 | |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | |
| Mouse anti-CD63 | Developmental Studies Hybridoma Bank | H5C6 | |
| Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit | Life Technologies | A20187 | |
| Hemacytometer Bright Line | Hausser Scientific | 1492 | |
| Forceps | EMS | 78320 | |
| Sorvall Legend RT + Centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 |
References
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils. Front Microbiol. 2, 77 (2011).
- Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes. Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).
- Seib, K. L., et al. Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay. Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).
- Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes. Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. J. Vis. Exp. (49), e2693 (2011).
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).
- Dorward, D. W. Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions. Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).
- Yang, L., et al. Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer. Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).
- Mueller, R. S., et al. Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization. J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).
- Shen, C., et al. Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).
- Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques. J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp.. (17), e745 (2008).
- Allen, L. A. Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils. Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).
- Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications. Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).
- Chow, O. A., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).
- Thulin, P., et al. Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection. PLoS Med. 3, e53 (2006).
- Kubica, M., et al. A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages. PLoS One. 3, (2008).
- Swords, W. E., et al. Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro. Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).
- Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells. Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).
- Martinez, A. N., et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).
- Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).
- Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages. J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).
- Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp. FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).
- Morse, S. A., Bartenstein, L. Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine. Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils. Cell Microbiol. , (2013).
- Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain. BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).
