स्तनधारी कोशिकाओं के सहयोग से बैक्टीरिया की व्यवहार्यता का निर्धारण के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तरीके
Summary
बैक्टीरियल रोगजनन के क्षेत्र के लिए केन्द्रीय रोगाणुओं कोशिकाओं के लिए जोखिम के बाद जीवित कैसे यदि और परिभाषित करने की क्षमता है. इस लेख के अंदर और मेजबान कोशिकाओं के साथ जुड़े व्यक्ति बैक्टीरिया की व्यवहार्यता का पता चलता है कि फ्लोरोसेंट रंगों के इस्तेमाल के लिए प्रोटोकॉल की रूपरेखा.
Abstract
बैक्टीरियल रोगजनन के क्षेत्र के लिए केन्द्रीय रोगाणुओं कोशिकाओं के लिए जोखिम के बाद जीवित कैसे यदि और परिभाषित करने की क्षमता है. इन सवालों का पता करने के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल कॉलोनी गिनती assays, gentamicin संरक्षण assays, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी शामिल हैं. कालोनी की गिनती और gentamicin संरक्षण assays ही पूरे बैक्टीरियल आबादी की व्यवहार्यता का आकलन और व्यक्तिगत बैक्टीरियल व्यवहार्यता का निर्धारण करने में असमर्थ हैं. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी व्यक्तिगत बैक्टीरिया की व्यवहार्यता का निर्धारण और मेजबान कोशिकाओं में उनके स्थानीयकरण के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, बैक्टीरिया अक्सर व्यवहार्यता का आकलन मुश्किल बना इलेक्ट्रॉन घनत्व की एक श्रृंखला प्रदर्शित करते हैं. इस लेख के अंदर और मेजबान कोशिकाओं के साथ जुड़े व्यक्ति बैक्टीरिया की व्यवहार्यता का पता चलता है कि फ्लोरोसेंट रंगों के इस्तेमाल के लिए प्रोटोकॉल की रूपरेखा. ये assays प्राथमिक मानव neutrophils में नेइसेरिया gonorrhoeae के अस्तित्व का आकलन करने के लिए मूल रूप से विकसित किए गए, लेकिन एक होना चाहिएकिसी भी जीवाणु मेजबान सेल बातचीत करने pplicable. इन प्रोटोकॉल झिल्ली पारगम्य फ्लोरोसेंट रंगों गठबंधन करने के लिए ही उपलब्ध हैं, जो झिल्ली अभेद्य फ्लोरोसेंट रंजक (propidium आयोडाइड और Sytox ग्रीन), के साथ, सभी बैक्टीरिया दाग जो (SYTO9 और 4 ',6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), nonviable बैक्टीरिया. पिछले यूकेरियोटिक सेल permeabilization के लिए, एक एंटीबॉडी या फ्लोरोसेंट अभिकर्मक कोशिकी बैक्टीरिया की पहचान करने के लिए जोड़ा गया है. इस प्रकार इन assays कोशिकाओं को और अंदर पक्षपाती बैक्टीरिया की व्यवहार्यता भेदभाव. एक प्रोटोकॉल भी व्यक्ति बैक्टीरिया के subcellular स्थानीयकरण का निर्धारण करने के क्रम में, यूकेरियोटिक सेल मार्कर फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ संयोजन में व्यवहार्यता रंगों का उपयोग के लिए प्रदान की जाती है. इस लेख में चर्चा बैक्टीरियल व्यवहार्यता रंगों व्यक्तिगत बैक्टीरिया की व्यवहार्यता का मूल्यांकन और बैक्टीरिया मेजबान सेल में जीवित जहां के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए पारंपरिक सूक्ष्म जीव विज्ञान तकनीक के लिए एक संवेदनशील पूरक और / या वैकल्पिक हैंएस.
Introduction
एक गतिशील बातचीत और जिसमें वे रहते बैक्टीरिया और मेजबान के बीच सह विकास है. जीवाणु पालन organelles, स्राव प्रणाली, और / या मेजबान phagocytic और गैर phagocytic कोशिकाओं की उनकी उत्पादक संक्रमण को सक्षम है कि विषाक्त पदार्थों का उत्पादन करने की क्षमता विकसित किया है. बैक्टीरिया भी मान्यता और मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली की रोगाणुरोधी गतिविधियों के साथ संघर्ष करना होगा. मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली भौतिक और रासायनिक बाधाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, पूरक प्रणाली, और humoral रोगक्षमता के अन्य घटकों सहित सहज और अनुकूली घटकों के शामिल है. कई बैक्टीरिया बहुस्तरीय मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया द्वारा हत्या और निकासी के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, कुछ रोगजनक और अवसरवादी बैक्टीरिया मेजबान कोशिकाओं की एक किस्म को संक्रमित और मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 1 से निकासी नाश के लिए तंत्र विकसित किया है. नेइसेरिया gonorrhoeae एक जीवाणु रोगज़नक़ का एक उदाहरण है कि अत्यधिक अपने मानव मेजबान. एन में जारी रहती है के लिए अनुकूल है. gonorrhoeae आसानी मूत्रजननांगी पथ, ग्रसनी, कंजाक्तिवा, और मलाशय के mucosal उपकला कोशिकाओं की luminal सतहों colonizes. औपनिवेशीकरण mucosal स्थलों पर neutrophils की प्रचुर मात्रा में भर्ती हो सके. न्यूट्रोफिल सूक्ष्मजीवों को मारने के लिए रोगाणुरोधी प्रक्रियाओं की एक किस्म के अधिकारी हैं कि पेशेवर फ़ैगोसाइट हैं, लेकिन, एन gonorrhoeae neutrophils 2-5 की उपस्थिति में जीवित करने में सक्षम है. ऐसी एन के रूप में कैसे बैक्टीरियल रोगज़नक़ों को समझना gonorrhoeae, नाश को दबाने, और अंत में सामान्य रूप से प्रतिकूल मेजबान वातावरण में जीवित रहने के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया अपहरण संक्रामक रोगों का मुकाबला करने के लिए नए उपचारों के विकास के लिए महत्वपूर्ण है.
अक्सर मेजबान कोशिकाओं में बैक्टीरिया जीवित रहने की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल कॉलोनी गिनती assays, gentamicin संरक्षण assays, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी शामिल हैं. कॉलोनी की गिनती assays में संक्रमित कोशिकाओं की आबादी क एक साबुन के साथ, उदाहरण के लिए (lysed हैआईसीएच बैक्टीरिया बैक्टीरिया को आजाद कराने के लिए) प्रतिरोधी रहे हैं. lysates पतला और अगर आधारित मीडिया पर चढ़ाया, और lysates में कॉलोनी के गठन इकाइयों हर समय बिंदु और / या प्रयोगात्मक हालत के लिए enumerated हैं कर रहे हैं. यह दृष्टिकोण पूरी बैक्टीरियल आबादी की व्यवहार्यता रिपोर्ट लेकिन intracellular और बाह्य अस्तित्व के बीच फर्क करने में सक्षम नहीं है. कॉलोनी की गिनती परख, gentamicin संरक्षण परख, पर एक बदलाव विशेष रूप से यूकेरियोटिक प्लाज्मा झिल्ली 6 पार करने के लिए एंटीबायोटिक gentamicin की अक्षमता के आधार पर intracellular बैक्टीरियल अस्तित्व, के उपाय. हालांकि, इस परख gentamicin (या इसी यूकेरियोटिक झिल्ली impermeant है कि एक और एंटीबायोटिक) और आंतरिक बैक्टीरिया के लिए उपयोग करने के लिए एंटीबायोटिक की अक्षमता से हत्या करने के लिए अतिसंवेदनशील किया जा रहा है बैक्टीरिया पर निर्भर है. इसलिए, एक gentamicin संरक्षण परख सभी प्रजातियों के जीवाणु की परीक्षा के लिए प्रभावी हो सकता है या नहीं हो सकता है अत्यधिक में बैक्टीरिया जीवित रहने की जब जांचऐसे neutrophils के रूप pinocytic कोशिकाओं. (बैक्टीरिया समुच्चय या अलग ढंग से व्यक्तिगत बैक्टीरियल कोशिकाओं से व्यवहार करते हैं कि microcolonies फार्म अगर उदाहरण के लिए) इन तरीकों से न तो subcellular स्थानीयकरण या व्यक्तिगत बैक्टीरिया के अन्य व्यवहार का पता चलता है. व्यक्तिगत बाह्य और आंतरिक बैक्टीरिया की व्यवहार्यता की जांच करने के लिए एक और अक्सर इस्तेमाल किया दृष्टिकोण पतली धारा ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) है. यह दृष्टिकोण यह आगे subcellular मार्कर के खिलाफ सोने युग्मित एंटीबॉडी के साथ immunoelectron माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की जा सकती है, जो मेजबान कोशिकाओं में बैक्टीरिया के स्थान (जैसे फेगोसोम, कोशिका द्रव्य, autophagosome), के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं कि में फायदेमंद है. हालांकि, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी बैक्टीरियल व्यवहार्यता का आकलन करने पर विशेष रूप से संवेदनशील नहीं है. एम्बेडेड वर्गों uranyl एसीटेट, नेतृत्व साइट्रेट, या अन्य इलेक्ट्रॉन घने अभिकर्मकों के साथ दाग और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged रहे हैं, इलेक्ट्रॉन घने बैक्टीरिया व्यवहार्य और चुनाव में माना जाता हैTron-LUCENT nonviable 7,8. हालांकि, इस धारणा को गंभीर रूप से बाधित झिल्ली और कोशिका द्रव्य से रहित साथ ही उन मृत बैक्टीरिया के बाद से इलेक्ट्रॉन प्रकाशमान दिखाई देते हैं, बैक्टीरियल व्यवहार्यता overestimates. इसके अलावा, कुछ प्रजातियों के जीवाणु के लिए यह मुश्किल व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए कर रही है, विकास के अपने स्तर पर निर्भर करता है इलेक्ट्रॉन घनत्व की एक श्रृंखला प्रदर्शित कर सकता है.
एक विकल्प या इन व्यापक रूप से इस्तेमाल के तरीकों के अलावा, यहाँ हम से जुड़ी है और मेजबान कोशिकाओं से भली भाँति बैक्टीरिया के अस्तित्व का आकलन करने के लिए जीवाणु व्यवहार्यता से संकेत मिलता है कि फ्लोरोसेंट रंगों के इस्तेमाल के लिए प्रोटोकॉल और औचित्य प्रदान करते हैं. कोशिकी बैक्टीरिया की पहचान करने के लिए, संक्रमित कोशिकाओं को पहले इस तरह के एक लेक्टिन या बैक्टीरिया विशिष्ट एंटीबॉडी के रूप में एक फ्लोरोसेंट अभिकर्मक, के संपर्क में हैं. संक्रमित कोशिकाओं को फिर permeabilized और बैक्टीरियल व्यवहार्यता के लिए एक किराए के रूप में, अपमानित झिल्ली बनाम बरकरार के साथ बैक्टीरिया को विभिन्न प्रकार से सुलभ हैं कि डीएनए विशिष्ट रंगों के संपर्क में हैं. पहले पी मेंpropidium आयोडाइड झिल्ली से समझौता किया है और इस तरह nonviable माना जाता है कि उन बैक्टीरिया को ही सुलभ है, जबकि rotocol, झिल्ली पारगम्य डाई SYTO9, कुल बैक्टीरियल आबादी को पहचानती है. Propidium आयोडाइड और SYTO9, biofilms में बैक्टीरियल व्यवहार्यता का मूल्यांकन nonpathogenic बैक्टीरिया से रोगजनक भेदभाव, और व्यवहार्य जल जनित बैक्टीरिया 9-12 गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. Sytox ग्रीन nonviable आबादी के लिए ही उपलब्ध है, जबकि दूसरा प्रोटोकॉल में, 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI), कुल बैक्टीरिया की पहचान करता है. ये व्यवहार्यता डाई जोड़े बैक्टीरियल subcellular स्थानीयकरण परिभाषित करने के लिए उदाहरण के लिए, ब्याज की एक प्रोटीन के संबंध में प्रत्येक जीवाणु के स्थान को निर्धारित करने के लिए immunofluorescence के साथ जोड़ा जा सकता है. इन assays का उपयोग मेजबान कोशिकाओं के संक्रमण के दौरान बैक्टीरियल हत्या या अस्तित्व में होने वाली बातचीत में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है. इस अनुच्छेद में उल्लिखित प्रोटोकॉल व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गयान्युट्रोफिल phagosomes 5,13,14 के विभिन्न आबादी में सहित प्राथमिक मानव neutrophils, करने के लिए और अंदर संलग्न है कि एन gonorrhoeae. हालांकि, इन प्रोटोकॉल पेशेवर फ़ैगोसाइट, गैर पेशेवर फ़ैगोसाइट, और प्रोटोजोआ 15-24 में ग्राम पॉजिटिव और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
डीएनए मानव कोशिकाओं को और अंदर संलग्न रहते हैं और मृत बैक्टीरिया की पहचान करने के लिए एक फ्लोरोसेंट लेक्टिन के साथ संयोजन के रूप में बाध्यकारी और व्यवहार्यता रंगों का उपयोग करने वाले दो प्रोटोकॉल पर ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए अस्य स्मिर्नोव और लौरा Gonyar धन्यवाद. इस काम AKCMBJ को अनुदान एनआईएच R00 TW008042 और R01 AI097312 एनआईएच T32 AI007046 द्वारा समर्थित किया गया था द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 3/4 butterfly needles for blood collection | Becton Dickinson | 367251 | |
| Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml | Becton Dickinson | 366480 | |
| Sterile water for irrigation | Baxter | 07-09-64-070 | |
| Dextran 500 | Sigma | 31392 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S641 | |
| Dextrose | Ricca Chemical Company | RDCD0200 | |
| Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+ | Thermo Scientific | SH3002802 | |
| Ficoll solution | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401 | |
| 12 mm circular glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| 24-well plates | Corning Incorporated | 3524 | |
| Pooled Human Serum | Sigma | S7023 | |
| RPMI | Mediatech | 15-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007103 | |
| Human interleukin-8 | R&D Systems | 208-IL/CF | |
| MOPS | Sigma | M3183 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214 | |
| Propidium Iodide | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| SYTO9 | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| Saponin | Fluka Analytical | 47036 | |
| Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin | Life Technologies | L-32463 | |
| DAPI | Sigma | D8417 | |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | |
| Mouse anti-CD63 | Developmental Studies Hybridoma Bank | H5C6 | |
| Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit | Life Technologies | A20187 | |
| Hemacytometer Bright Line | Hausser Scientific | 1492 | |
| Forceps | EMS | 78320 | |
| Sorvall Legend RT + Centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 |
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