포유 동물 세포와 관련있는 박테리아의 생존을 확인하는 방법에 대한 형광 현미경 방법
Summary
세균성 병인 분야의 중심에는 미생물이 진핵 세포에 노출 된 후 생존 방법 경우 정의 할 수있는 기능입니다. 이 문서는 내부와 숙주 세포와 관련된 개별 박테리아의 생존을 공개 형광 염료의 사용에 대한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
세균성 병인 분야의 중심에는 미생물이 진핵 세포에 노출 된 후 생존 방법 경우 정의 할 수있는 기능입니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 현재의 프로토콜은 식민지 카운트 분석, 겐타 마이신 보호 분석 및 전자 현미경 (가) 있습니다. 콜로니 수와 겐타 마이신 보호 분석은 전체 세균 집단의 생존 능력을 평가하고 각각의 세균 가능성을 확인할 수 없습니다. 전자 현미경 개별 박테리아의 생존을 결정하고 숙주 세포에서의 지역화에 관한 정보를 제공하는데 사용될 수있다. 그러나 박테리아는 종종 생존 능력의 평가는 어렵게, 전자 밀도의 범위를 표시합니다. 이 문서는 내부와 숙주 세포와 관련된 개별 박테리아의 생존을 공개 형광 염료의 사용에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 분석은 인간의 기본 호중구에 임균의 생존을 평가하기 위해 원래 개발 된, 그러나해야한다어떤 박테리아 숙주 세포의 상호 작용에 pplicable. 이러한 프로토콜은 막 투과 형광 염료 결합 만 액세스 할 수있는 막 투과성 형광 염료 (요오드화 프로피 듐 및 SYTOX 녹색)로, 모든 박테리아를 얼룩 (SYTO9 및 4 ', 6 – diamidino -2 – 페닐 인돌 [DAPI), 생존 할 박테리아. 종래 진핵 세포 permeabilization에, 항체 또는 형광 시약을 세포 외 박테리아를 식별하기 위해 추가된다. 따라서 이러한 분석은 진핵 세포와 내부에 부착 박테리아의 생존 능력을 차별. 프로토콜은 또한 개별 박테리아 세포 내 현지화를 결정하기 위해, 진핵 세포 마커 형광 항체와 조합 생존력 염료를 사용하여 제공된다. 이 문서에서 설명하는 박테리아의 생존 염료 개별 박테리아의 생존 능력을 평가하고 박테리아가 숙주 세포에서 살아 남기 위치에 관한 정보를 제공하기 위해 기존의 미생물 기술에 민감한 보완 및 / 또는 대안의.
Introduction
동적 상호 작용과 그들이 거주하는 박테리아와 호스트 사이의 공동 발전이있다. 박테리아 부착 소기관, 분비 시스템, 및 / 또는 호스트 식세포 및 비 식세포 그들의 생산적 감염을 활성화 독소를 생산하는 능력을 진화 해왔다. 박테리아는 또한 인식과 숙주 면역 시스템의 항균 활동을 주장해야합니다. 숙주 면역 시스템은 물리적 및 화학적 장벽, 면역 세포, 보체계 및 체액 성 면역의 다른 구성 요소들을 포함하는 선천성 및 적응 구성 요소로 구성된다. 많은 박테리아가 다층 호스트 면역 반응에 의해 살해 및 통관에 민감하지만, 몇 가지 병원성 및 기회 박테리아가 숙주 세포의 다양한 감염 및 숙주 면역 반응 (1)에 의해 허가를 파괴하는 메커니즘을 진화했다. 임균은 세균성 병원체의 한 예입니다 그는 매우 그 사람의 호스트. N에서 지속하도록되어있다. 임질은 쉽게 비뇨 생식기의 기관, 인두, 결막, 그리고 직장의 점막 상피 세포의 내강 표면을 식민지화한다. 식민지 점막 사이트에서 호중구의 풍부한 모집을 트리거합니다. 호중구는 미생물을 죽이는 항균 다양한 공정을 가지고 전문 식세포 있습니다하지만, N. 임질은 호중구 2-5의 존재하에 생존 할 수있다. 같은 N. 같은 방법 세균성 병원균에 대한 이해 임질은, 파괴 억제하고 궁극적으로 일반적으로 적대적 호스트 환경에서 살아 남기 위해 면역 반응을 납치하는 것은 전염성 질병을 퇴치에 대한 새로운 치료법의 개발에 매우 중요합니다.
종종 숙주 세포에서 박테리아의 생존을 조사하는 데 사용 실험 프로토콜은 식민지 카운트 분석, 겐타 마이신 보호 분석 및 전자 현미경 (가) 있습니다. 콜로니 카운트 분석법에서, 감염 세포의 집단은 ㅁ하는 세제, 예를 들어 (용해된다무형 문화 유산 박테리아는 박테리아를 해방하는) 저항한다. 해물 희석 한천 기반 미디어에 도금하고, 용 해물의 콜로니 형성 단위는 각 시점 및 / 또는 실험 조건에 대해 열거된다. 이 접근법은 전체 세균 집단의 생존 능력을보고하지만, 세포 내 및 세포 생존을 구별 할 수 없다는 것이다. 식민지 카운트 분석, 겐타 마이신 보호 분석에 변화가 구체적으로 진핵 생물의 세포막 6 교차하는 항생제 겐타 마이신의 무능력에 따라 세포 내 박테리아의 생존을 측정한다. 그러나이 분석은 겐타 마이신 (또는 유사 진핵 막 impermeant 또 다른 항생제)와 내부 박테리아에 액세스 할 수있는 항생제의 무능력에 의해 살해에 감염되는 박테리아에 의존합니다. 따라서, 겐타 마이신 보호 분석은 모든 세균 종의 검사를 위해 효과적 일 또는하지 않을 수 있습니다 높은 세균의 생존을 검사 할 때이러한 호중구로 pinocytic 세포. (박테리아가 집계 또는 다른 개별 박테리아 세포에서 행동 microcolonies을 형성하는 경우 예) 둘 중 어떤 방법을 사용해도 세포 내 현지화 각각의 박테리아 또는 다른 동작을 보여준다. 각각의 외부 및 내부 박테리아의 생존을 조사하는 또 다른 자주 사용되는 방법은 얇은 단면 투과 전자 현미경 (TEM)이다. 이 방법은 상기 세포 내 마커에 대해 골드 결합 항체로 면역 전자 현미경으로 조사 할 수있는 숙주 세포에서 박테리아의 위치 (예 phagosome에, 세포질 autophagosome)에 관한 정보를 제공 할 수 있다는 점에서 유리하다. 그러나 전자 현미경은 세균의 생존 능력을 평가에 특히 구분하지 않습니다. 포함 된 섹션은 우라 닐 아세테이트, 리드 시트 레이트, 또는 다른 전자 밀도 시약으로 염색과 전자 현미경에 의해 촬영하는 경우, 전자 밀도가 박테리아는 생존과 ELEC 간주됩니다트론 – 루슨트 생존 할 7,8. 그러나이 가정은 심각한 혼란 세포막과 세포질의 결여와 만 죽은 박테리아 때문에 전자 – 루슨트 표시, 세균의 생존 능력을 과대 평가. 또한, 일부 세균 종은 어려운 생존력을 결정하게하는, 성장의 그들의 단계에 따라 전자 밀도의 범위를 표시 할 수있다.
대체 또는 이러한 널리 사용되는 방법에 추가로, 여기에서 우리는에 부착 숙주 세포에 의해 내면화 된 박테리아의 생존을 평가하는 세균 생존 능력을 나타내는 형광 염료의 사용을위한 프로토콜과 이론적 근거를 제공한다. 세포 외 박테리아를 식별하기 위해, 감염된 세포는 최초의 렉틴이나 박테리아의 특정 항체로 형광 시약에 노출되어 있습니다. 감염된 세포는 다음 permeabilized 및 세균 생존을위한 대리로, 성능이 저하 된 막 대 손상과 세균에 차별적으로 액세스 할 수있는 DNA 특정 염료에 노출되어 있습니다. 제 P 있음프로피 디움 요오드는 세포막을 손상하고, 따라서 생존 불가능한 것으로 간주되는 그 박테리아 만이 액세스 할 수있는 동안 rotocol, 막 투과성 염색 SYTO9는 총 세균 집단을 식별합니다. 프로피 디움 요오드 및 SYTO9는 바이오 필름 세균 생존 능력을 평가하는 비병원성 박테리아 병원성 차별, 실행 가능한 수 인성 박테리아 9-12을 열거하는 데 사용되었습니다. SYTOX 녹색 생존 할 인구 만 액세스 할 수있는 동안 두 번째 프로토콜에서, 4 ', 6'-diamidino -2 – 페닐 인돌 (DAPI)는 총 박테리아를 식별합니다. 이들 생존 염료 쌍은 박테리아 세포 내 현지화를 정의하는 예를 들어, 관심있는 단백질과 관련하여, 각 세균의 위치를 결정하기 위해 면역 형광과 결합 될 수있다. 이러한 분석법의 사용은 숙주 세포의 감염시 세균 살상 또는 생존을 초래할 상호 작용에 대한 통찰력을 제공한다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 생존을 평가하기 위해 사용되었다호중구 된 phagosomes 5,13,14의 다른 인구를 포함하여 인간의 기본 호중구와 내부에 부착되어 N. 임질. 그러나, 이들 프로토콜은 프로 식세포, 비전문 식세포 및 원생 동물에 15-24 그람 양성 및 그람 음성 세균의 생존 능력을 평가하기 위해 적용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA는 인간의 세포와 내부에 부착 된 라이브 및 죽은 박테리아를 식별 할 수있는 형광 렉틴과 함께 결합과 생존의 염료를 사용하는 두 개의 프로토콜은 여기에서 소개하고 있습니다. 두 프로토콜 효과적으로 사균의 라이브 판별하기 때문에, 사용하는 프로토콜의 선택은 실험의 목표에 의존한다. 제 1 프로토콜은 생존 불가능한 박테리아 그대로 박테리아를 검출하는 SYTO9를 검출 프로피 듐 요오다 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고의 중요한 읽기 아샤 스 미르 노프와 Laura Gonyar 감사합니다. 이 작품은 AKCMBJ 보조금 NIH R00 TW008042 및 R01 AI097312는 NIH T32 AI007046에 의해 부분적으로 지원되었다에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 3/4 butterfly needles for blood collection | Becton Dickinson | 367251 | |
| Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml | Becton Dickinson | 366480 | |
| Sterile water for irrigation | Baxter | 07-09-64-070 | |
| Dextran 500 | Sigma | 31392 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S641 | |
| Dextrose | Ricca Chemical Company | RDCD0200 | |
| Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+ | Thermo Scientific | SH3002802 | |
| Ficoll solution | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401 | |
| 12 mm circular glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| 24-well plates | Corning Incorporated | 3524 | |
| Pooled Human Serum | Sigma | S7023 | |
| RPMI | Mediatech | 15-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007103 | |
| Human interleukin-8 | R&D Systems | 208-IL/CF | |
| MOPS | Sigma | M3183 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214 | |
| Propidium Iodide | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| SYTO9 | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| Saponin | Fluka Analytical | 47036 | |
| Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin | Life Technologies | L-32463 | |
| DAPI | Sigma | D8417 | |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | |
| Mouse anti-CD63 | Developmental Studies Hybridoma Bank | H5C6 | |
| Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit | Life Technologies | A20187 | |
| Hemacytometer Bright Line | Hausser Scientific | 1492 | |
| Forceps | EMS | 78320 | |
| Sorvall Legend RT + Centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 |
References
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils. Front Microbiol. 2, 77 (2011).
- Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes. Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).
- Seib, K. L., et al. Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay. Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).
- Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes. Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. J. Vis. Exp. (49), e2693 (2011).
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).
- Dorward, D. W. Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions. Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).
- Yang, L., et al. Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer. Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).
- Mueller, R. S., et al. Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization. J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).
- Shen, C., et al. Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).
- Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques. J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp.. (17), e745 (2008).
- Allen, L. A. Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils. Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).
- Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications. Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).
- Chow, O. A., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).
- Thulin, P., et al. Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection. PLoS Med. 3, e53 (2006).
- Kubica, M., et al. A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages. PLoS One. 3, (2008).
- Swords, W. E., et al. Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro. Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).
- Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells. Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).
- Martinez, A. N., et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).
- Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).
- Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages. J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).
- Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp. FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).
- Morse, S. A., Bartenstein, L. Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine. Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils. Cell Microbiol. , (2013).
- Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain. BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).
