Fluorescensmikroskopi metoder for å bestemme levedyktigheten til bakterier i foreningen med pattedyrceller

Summary

Sentralt til feltet av bakteriell patogenesen er evnen til å definere om og hvordan mikrober overlever etter eksponering for eukaryote celler. Denne artikkelen beskriver protokoller for ved bruk av fluorescerende fargestoffer som viser levedyktigheten til de enkelte bakterier i og er forbundet med vertsceller.

Abstract

Sentralt til feltet av bakteriell patogenesen er evnen til å definere om og hvordan mikrober overlever etter eksponering for eukaryote celler. Nåværende protokoller for å håndtere disse spørsmålene omfatter kimtall analyser, gentamicin beskyttelse analyser, og elektronmikroskopi. Kimtall og gentamicin beskyttelse analyser bare vurdere levedyktigheten av hele bakteriepopulasjon og er ute av stand til å avgjøre enkelt bakteriell levedyktighet. Elektronmikroskopi kan brukes til å bestemme levedyktigheten til de enkelte bakterier og gi informasjon med hensyn til deres lokalisering i vertsceller. Imidlertid bakterier ofte et utvalg av elektron-tettheter, slik at evaluering av levedyktighet vanskelig. Denne artikkelen beskriver protokoller for ved bruk av fluorescerende fargestoffer som viser levedyktigheten til de enkelte bakterier i og er forbundet med vertsceller. Disse analysene ble opprinnelig utviklet for å vurdere overlevelse av Neisseria gonorrhoeae i primære humane nøytrofiler, men bør være enpplicable til enhver bakterie-verten celle interaksjon. Disse protokollene kombinere membran-gjennomtrengelige fluorescerende fargestoffer (SYTO9 og 4 ',6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), som flekker alle bakterier, og membran-ugjennomtrengelig fluorescerende fargestoffer (propidium jodid og SYTOX grønt), som bare er tilgjengelig for ikke-levedyktige bakterier. Før eukaryot celle permeabilization, er et antistoff eller fluorescerende reagens tilsettes for å identifisere ekstracellulære bakterier. Dermed disse assays diskriminere levedyktigheten til bakteriene vedheftende til og i eukaryote celler. En protokoll er også tilveiebrakt for bruk av levedyktighet fargestoffer i kombinasjon med fluoriserende antistoffer mot eukaryotiske celle markører, for å bestemme den subcellulære lokalisering av de enkelte bakterier. Den bakterielle levedyktighet fargestoffer omtalt i denne artikkelen er en følsom supplement og / eller alternativ til tradisjonelle mikrobiologi teknikker for å evaluere levedyktighet av individuelle bakterier og gi informasjon om hvor bakterier overleve i vertscelles.

Introduction

Det er et dynamisk samspill og co-evolusjon mellom bakterier og vertene der de bor. Bakterier har utviklet seg tilslutning organeller, sekresjons-systemer, og / eller evnen til å produsere toksiner som muliggjør deres produktiv infeksjon av verts fagocytisk og ikke-fagocytiske celler. Bakteriene må også kjempe med anerkjennelse og antimikrobielle aktiviteter av vertens immunsystem. Vertsimmunsystemet består av medfødt og adaptiv komponenter, inkludert fysiske og kjemiske barrierer, immunceller, komplementsystemet, og andre komponenter av humoral immunitet. Mens mange bakterier er utsatt for avliving og klaring av det flerlags vertsimmunrespons, har noen patogene og opportunistisk bakterier utviklet mekanismer for å infisere en rekke vertsceller og undergrave klaring av vertsimmunrespons ^1.. Neisseria gonorrhoeae er et eksempel på et bakterielt patogen som er sterkt tilpasset til å vedvare i sin menneskelige vert. N. gonorrhoeae lett koloniserer luminal flater av mukosale epitelceller i urogenitaltraktus, svelg, øyets bindehinne, og rektum. Colonization utløser rikelig rekruttering av nøytrofile ved slimhinnesider. Nøytrofiler er profesjonelle fagocytter som besitter en rekke antimikrobielle prosesser for å drepe mikroorganismer, men N. gonorrhoeae er i stand til å overleve i nærvær av neutrofiler ^2-5. Forstå hvordan bakterielle patogener som N. gonorrhoeae grave, undertrykke, og kapre immunrespons til slutt overleve i normalt fiendtlige vertsmiljøer er avgjørende for utviklingen av nye behandlingsformer for å bekjempe smittsomme sykdommer.

Eksperimentelle protokoller ofte brukes til å undersøke overlevelse av bakterier i vertsceller omfatter kimtall analyser, gentamicin beskyttelse analyser, og elektronmikroskopi. I kimtall analyser, er en befolkning på infiserte celler lysert (for eksempel med et vaskemiddel, r.ich bakteriene er resistente) for å frigjøre bakterier. De lysater blir fortynnet og sådd ut på agar-baserte media, og koloni-dannende enheter i lysatene er oppregnet for hvert tidspunkt og / eller eksperimentelle tilstand. Denne tilnærmingen rapporterer levedyktigheten av hele bakteriepopulasjon, men er ikke i stand til å skille mellom intracellulært og ekstracellulært overlevelse. En variant av den kimtall analyse ble gentamicin beskyttelses assay måler spesielt intracellulær bakteriell overlevelse, på grunnlag av den manglende evnen av de antibiotiske gentamicin å krysse eukaryot plasma membran ^6.. Imidlertid er denne analysen er avhengig av bakteriene blir utsatt for å drepe av gentamicin (eller et annet antibiotikum som er tilsvarende eukaryote membran-impermeant) og manglende evne av antibiotika for å få tilgang til indre bakterier. Derfor kan en gentamicin beskyttelse analysen ikke være effektive for undersøkelse av alle bakterielle arter eller når undersøke overlevelse av bakterier høytpinocytic celler som nøytrofile. Ingen av disse tilnærmingene avslører subcellulære lokalisering eller annen oppførsel av enkelte bakterier (f.eks hvis bakterier danner aggregater eller-mikro som oppfører seg annerledes enn enkelte bakterieceller). Et annet ofte brukt metode for å undersøke gjennomførbarheten av de enkelte eksterne og interne bakterier er tynn-snitt transmisjonselektronmikroskopi (TEM). Denne fremgangsmåten er fordelaktig ved at det kan gi informasjon angående beliggenheten av bakteriene i vertsceller (f.eks phagosome, cytoplasma, autophagosome), som kan bli ytterligere undersøkt ved mikroskopi immunoelectron med gull-koplet antistoffer mot subcellulære markører. Imidlertid er elektronmikroskopi ikke spesielt følsom ved å vurdere bakteriell levedyktighet. Når innebygde seksjoner er farget med uranyl-acetat, bly-citrat eller andre elektron-tette reagenser og avbildes ved elektronmikroskopi, er elektron-tette bakterier betraktes levedyktig og elektron-Lucent nonviable ^7,8. Men overvurderer denne antakelsen bakteriell levedyktighet, siden bare de døde bakterier med alvorlig forstyrret membraner og blottet for cytoplasma vises elektron-Lucent. I tillegg kan enkelte bakteriearter viser et utvalg av elektrontetthet avhengig av deres vekstfase, som gjør det vanskelig å bestemme levedyktigheten.

Som et alternativ eller i tillegg til disse brukte metoder, her vi gi protokoller og begrunnelse for bruk av fluorescerende fargestoffer som indikerer bakteriell levedyktighet for å vurdere overlevelse av bakteriene som er koblet til og internalis av vertsceller. For å identifisere ekstracellulære bakterier, blir infiserte celler først eksponert for en fluorescerende reagens, for eksempel en lektin-eller bakterie-spesifikke antistoff. De infiserte cellene blir deretter permeabilized og utsatt for DNA-spesifikke fargestoffer som er differensielt tilgjengelig for bakterier med intakt g. degradert membraner, som et surrogat for bakteriell levedyktighet. I den første protocol, identifiserer membranen gjennomtrengelig fargestoff SYTO9 den totale bakteriepopulasjon, mens propidium iodide er kun tilgjengelig for de bakteriene som har kompromittert membraner og er dermed å betrakte nonviable. Propidium iodide og SYTO9 har blitt brukt til å evaluere bakteriell levedyktighet i biofilm, diskriminere patogene fra nonpathogenic bakterier, og nummerere levedyktige vannbårne bakterier ^9-12. I den andre protokollen, 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) identifiserer totale bakterier, mens SYTOX Green er kun tilgjengelig for den ikke-levedyktig populasjon. Disse levedyktighet fargestoff parene kan kombineres med immunfluorescens å bestemme hver bakterie plassering i forhold til et protein av interesse, for eksempel for å definere bakteriell subcellulær lokalisering. Bruken av disse analysene gir viktig innsikt inn i de vekselvirkninger som gir bakterie-drepende eller overlevelse under infeksjon av vertsceller. Protokollene er skissert i denne artikkelen ble brukt til å vurdere levedyktighetenN. gonorrhoeae som er knyttet til og i primære humane nøytrofile, herunder i ulike populasjoner av nøytrofile phagosomes ^5,13,14. Imidlertid kan disse protokoller anvendes for å vurdere levedyktigheten til gram-positive og gram-negative bakterier i profesjonelle fagocytter, ikke-profesjonelle fagocytter, og protozoer ^15-24.

Protocol

En. Vurdere Bakteriell Levedyktighet med Propidium Jodid og SYTO9 Infisere celler som er tilhenger til 12 mm diameter sirkulære glass dekkglass i 24-brønners plater med bakterier av interesse. IKKE fikser cellene med aldehyder eller organiske løsemidler. Vask celler en gang forsiktig i 0,1 M 3 – (N-morfolino) propansulfonsyre (MOPS), pH 7,2, inneholdende 1 mM MgCl2 (MOPS / MgCl 2). Inkuber cellene i 10 minutter i mørke ved romtemperatur med Alexa …

Representative Results

De protokoller som er beskrevet ble brukt til å undersøke overlevelse av N. gonorrhoeae etter eksponering for primær menneskelig nøytrofile 5,26. Nøytrofile ble infisert med N. gonorrhoeae og behandles med protokollen 1, ved hjelp av den grønne fluorescerende fargestoff SYTO9 levedyktighet og den rød-fluorescerende propidium jodid (figur 4A). De fargestoffer som ble tilsatt i nærvær av saponin, som sequesters kolesterol til preferensielt permeabilize vertscelleplasm…

Discussion

Presenteres her er to protokoller som bruker DNA-binding og levedyktighet fargestoffer i forbindelse med et fluorescerende lectin å identifisere levende og døde bakterier festet til og i humane celler. Siden begge protokollene effektivt diskriminere levende fra døde bakterier, valg av hvilken protokoll som skal brukes avhenger av formålet med forsøket. Den første protokollen bruker propidium iodide å oppdage ikke-levedyktige bakterier og SYTO9 å oppdage intakte bakterier. Vist i figur 4A er et r…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
21 G 3/4 butterfly needles for blood collection	Becton Dickinson	367251
Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml	Becton Dickinson	366480
Sterile water for irrigation	Baxter	07-09-64-070
Dextran 500	Sigma	31392
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S641
Dextrose	Ricca Chemical Company	RDCD0200
Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+	Thermo Scientific	SH3002802
Ficoll solution	GE Healthcare	17-1440-03
Acetic Acid	Fisher Scientific	BP2401
12 mm circular glass coverslips	Fisher Scientific	12-545-80 12CIR-1
24-well plates	Corning Incorporated	3524
Pooled Human Serum	Sigma	S7023
RPMI	Mediatech	15-040-CV
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	SH3007103
Human interleukin-8	R&D Systems	208-IL/CF
MOPS	Sigma	M3183
MgCl2	Fisher Scientific	BP214
Propidium Iodide	Life Technologies	L7007 or L7012
SYTO9	Life Technologies	L7007 or L7012
Saponin	Fluka Analytical	47036
Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin	Life Technologies	L-32463
DAPI	Sigma	D8417
SYTOX Green	Life Technologies	S7020
Mouse anti-CD63	Developmental Studies Hybridoma Bank	H5C6
Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit	Life Technologies	A20187
Hemacytometer Bright Line	Hausser Scientific	1492
Forceps	EMS	78320
Sorvall Legend RT + Centrifuge	Thermo Scientific	75004377