Memeli Hücreleri ile Derneği'nin Bakterilerin Canlılık belirlenmesi için Floresan Mikroskopi Yöntemleri
Summary
Bakteriyel patojenez alanı merkezinde mikroplar ökaryotik hücrelere maruz kaldıktan sonra hayatta nasıl olursa ve tanımlamak için yeteneğidir. Bu makalede, iç ve konakçı hücreler ile ilgili ayrı ayrı bakterilerin canlılığı ortaya floresan boyaların kullanımı için protokolleri özetlenmektedir.
Abstract
Bakteriyel patojenez alanı merkezinde mikroplar ökaryotik hücrelere maruz kaldıktan sonra hayatta nasıl olursa ve tanımlamak için yeteneğidir. Bu soruları için geçerli protokollerin koloni sayımı tahlilleri, gentamisin koruma tahlilleri ve elektron mikroskobu. Koloni sayısı ve gentamisin koruma analizleri, yalnızca tüm bakteri nüfusunun canlılığını değerlendirmek ve bireysel bakteri canlılığını belirlemek mümkün değildir. Elektron mikroskobu ayrı ayrı bakterilerin yaşayabilirliği belirlemek ve ev sahibi hücrelerde lokalizasyon ile ilgili bilgi sağlamak için de kullanılabilir. Bununla birlikte, bakteriler sık sık canlılığının değerlendirilmesi zor hale elektron yoğunluklarının bir aralığını gösterir. Bu makalede, iç ve konakçı hücreler ile ilgili ayrı ayrı bakterilerin canlılığı ortaya floresan boyaların kullanımı için protokolleri özetlenmektedir. Bu deneyler birincil insan nötrofillerinde Neisseria gonorrhoeae hayatta kalmasını değerlendirmek için ilk olarak geliştirilmiş, ancak bir olmalıbir bakteri konakçı hücre etkileşimine pplicable. Bu protokoller, zar geçirgen floresan boyalar birleştirmek için erişilebilir membran geçirmeyen floresan boyalar (propidyum iyodür ve SYTOX Green) ile, tüm bakterileri leke (SYTO9 ve 4 ',6-diamidino-2-fenilindol [DAPI]) cansız bakteri. Önceki ökaryotik hücre nüfuziyet için, bir antikor ya da tepkin madde flüoresan hücre dışı bakteri belirlemek için ilave edilmektedir. Bu nedenle, bu deneyler, ökaryotik hücrelere ve iç yapışık bakteri canlılığı ayırt edebilir. Bir protokol, aynı zamanda ayrı ayrı bakterilerin hücre içi lokalizasyonu belirlemek amacıyla, ökaryotik hücre işaretleyicileri için floresan antikorlar ile kombinasyon halinde canlılığı boyalar kullanılarak sağlanır. Bu makalede açıklanan bakteriyel canlılığı boyalar ayrı ayrı bakterilerin canlılığı değerlendirmek ve bakteri konakçı hücre hayatta burada ile ilgili bilgi sağlamak için, geleneksel teknikler mikrobiyoloji için hassas bir tamamlayıcı ve / veya alternatifs.
Introduction
Dinamik bir etkileşim ve ikamet ettikleri bakteri ve bilgisayarlar arasında işbirliği evrim vardır. Bakteriler bağlılık organellere, salgı sistemleri ve / veya konak fagositik ve fagositik olmayan hücrelerin kendi üretken enfeksiyon etkinleştirmek toksin üretme yeteneği gelişmiştir. Bakteriler de tanıma ve konakçı bağışıklık sisteminin antimikrobiyal aktiviteleri ile uğraşmak gerekir. Ev sahibi, bağışıklık sistemi, fiziksel ve kimyasal engeller, bağışıklık hücreleri, tamamlayıcı sistemin, ve humoral bağışıklık diğer bileşenleri de dahil olmak üzere doğal ve adaptif bileşenden oluşur. Birçok bakteri tabakalı konak immün tepkisi ile öldürülmesi ve temizlik duyarlı olsa da, bazı patojenik ve fırsatçı bakterilerin konakçı hücrelerin çeşitli enfekte ve konak immün cevabı 1 ile açıklık bozmak için mekanizmalar geliştirmişlerdir. Neisseria gonorrhoeae bakteriyel patojen bir örneğidir Bu son derece insan konak. Yok inat uyarlanmıştır. gonorrhoeae kolayca ürogenital sistem, yutak, konjonktiva ve rektum mukoza epitelyal hücrelerin luminal yüzeyleri kolonize. Kolonizasyon mukozal sitelerde nötrofillerin bol işe tetikler. Nötrofiller mikroorganizmaları öldürmek için antimikrobiyal süreçlerin çeşitli sahip profesyonel fagositlerdir, ancak, N. gonorrhoeae nötrofillerin 2-5 mevcudiyetinde hayatta kalma yeteneğine sahiptir. Böyle N. nasıl gibi bakteriyel patojenler Anlamak gonorrhoeae, yıkmak bastırmak ve sonuçta normalde düşman konak ortamlarda hayatta kalmak için bağışıklık tepkisini kaçırmak bulaşıcı hastalıklarla mücadele için yeni tedavilerin geliştirilmesi için çok önemlidir.
Genellikle konakçı hücreler bakteriyel hayatta araştırmak için kullanılan deneysel protokol koloni sayısı deneyleri, gentamisin koruma tahlilleri ve elektron mikroskobu. Koloni sayısı deneylerinde, enfekte olmuş hücrelerin bir popülasyonu wh bir deterjan ile, örneğin, (parçalananaich bakteriler bakteri serbest bırakmak için) dirençlidir. Lizatlar seyreltildi ve agar bazlı ortam üzerine plakalanmıştır ve lizatlardaki koloni oluşturucu birim, her bir zaman noktasında ve / veya deney koşulu için numaralandırılır edilir. Bu yaklaşım, tüm bakteri nüfusunun canlılığı bildirir ancak hücre içi ve hücre dışı yaşam arasında ayırım yeteneğine sahip değildir. Koloni sayımı tahlili, gentamisin koruma deneyinde, bir varyasyonu özellikle ökaryotik plazma zarı 6 geçmeye antibiyotik gentamisin yetersizlik dayalı hücre içi bakteri hayatta, ölçer. Bununla birlikte, bu deney, gentamisin (ya da benzer bir ökaryotik membran geçirgen olmayan başka bir antibiyotik) ile iç bakterilere erişmek için antibiyotiğin yetersizlik ile öldürmeye karşı hassas olan bakteri bağlıdır. Bu nedenle, bir gentamisin koruma deneyi, tüm bakteri türlerinin incelenmesi için etkili ya da başka yüksek bakteriyel hayatta incelerkennötrofiller gibi pinocytic hücreleri. (Bakteri agrega ya da farklı bireysel bakteriyel hücrelerden davranır mikrokoloniler formu ise gibi) bu yaklaşımların hiçbiri hücre içi lokalizasyonu ya da ayrı ayrı bakterilerin diğer davranışları ortaya koymaktadır. Tek tek dış ve iç bakteri canlılığı incelemek için sıkça kullanılan bir başka yaklaşım, ince kesitli transmisyon elektron mikroskobu (TEM) 'dir. Bu yaklaşım daha fazla hücre içi işaretleri karşı altın bağlanmış antikorları ile immunoelectron mikroskobu ile incelenmiştir edilebilir konakçı hücrelerde bakterilerin yere (örneğin, fagosom, sitoplazma, autophagosome), ilgili bilgi sağlayabilir avantajlıdır. Bununla beraber, elektron mikroskobu bakteri uygunluğu değerlendirmek özellikle duyarlı değildir. Gömülü bölümler uranil asetat, kurşun sitrat veya diğer elektron yoğun reaktifleri ile boyanmış ve elektron mikroskopi ile görüntülenmiştir zaman, elektron-yoğun bakteri uygun ve elektrik olarak kabul edilirtron-Lucent cansız 7,8. Ancak, bu varsayım ciddi biçimde kesintiye membranların ve sitoplazma yoksun olan sadece bu ölü bakteri beri elektron-Lucent görünür, bakteri canlılığı overestimates. Ayrıca, bazı bakteri türlerinin zor canlılığını belirlemek için yapım büyüme aşamasına bağlı olarak, kendi elektron yoğunluklarının bir aralığını görüntüleyebilir.
Alternatif bir ya da bu yaygın olarak kullanılan yöntemlere ilave olarak olduğu gibi, burada eklenmiş ve konak hücreleri ile içeride bakterilerin hayatta kalmasını değerlendirmek için bakteriyel canlılığı göstermektedir floresan boyaların kullanımı için protokoller ve mantığını sağlar. Hücre dışı bakteriler belirlemek için, enfekte olmuş hücreler, ilk olarak bir lektin ya da bakteri özgü antikor gibi bir flüoresan tepkime maddesi, maruz kalmaktadır. Enfekte edilen hücreler daha sonra geçirgen ve bakteriyel canlılığı için bir vekil olarak, bozulmuş membran vs bozulmamış bakterilere farklı olarak erişilebilir DNA özgü boyalar maruz kalmaktadır. İlk olarak ppropidium iyodür membranlar tehlikeye ve böylece cansız kabul edilen bu bakterilerin sadece erişilebilir ise otokol, membran geçirgen boya SYTO9, toplam bakteri nüfusu tanımlar. Propidium iyodür ve SYTO9, Biyofilmlererde bakteri canlılığı değerlendirmek patojenik bakterilerin patojenik ayrımcılık ve uygulanabilir su-kaynaklı bakteri 9-12 numaralandırmak için kullanılır olmuştur. SYTOX Green cansız nüfusa erişilebilir iken, ikinci protokolde, 4 ', 6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI), toplam bakteri tanımlar. Bu canlılığı boya çifti bakteriyel hücre içi lokalizasyonu tanımlamak Örneğin, ilgi konusu bir protein ile ilgili olarak her bir bakterinin yerini belirlemek için bağışıklık ile kombine edilebilir. Bu tahlillerin kullanılması konak hücrelerin enfeksiyonu esnasında bakteri öldürme veya hayatta kalması ile sonuçlanabilir etkileşimler içine önemli bilgiler sağlar. Bu makalede anlatılan protokoller canlılığı ve değerlendirmek için kullanılmıştırNötrofil phagosomes 5,13,14 farklı toplumlarda da dahil olmak üzere temel insan nötrofil, ve içine bağlanmış olup, N. gonorrhoeae. Bununla birlikte, bu protokoller profesyonel fagositlerin, non-profesyonel fagositlerin ve protozoa 15-24 gram-pozitif ve gram-negatif bakterilerin uygulanabilirliğini değerlendirmek için uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA, insan hücrelerine ve içine bağlanmış canlı ve ölü bakteri belirlemek için bir flüoresan lektin ile bağlantılı olarak bağlanması ve canlılığı boyalar kullanan iki protokol burada sunulmuştur. Her iki protokol etkili ölü bakteri canlı ayırmak için, kullanımı protokol seçimi denemenin hedefi bağlıdır. Birinci protokol cansız bakteri ve sağlam bakteri tespit etmek için tespit SYTO9 propidiyum iyot kullanmaktadır. Şekil 4A'da gösterilen N bulaşmış ins…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz yazının eleştirel okuma için Asya Smirnov ve Laura Gonyar teşekkür ederim. Bu çalışma AKCMBJ hibe NIH R00 ve R01 TW008042 AI097312 NIH T32 AI007046 tarafından kısmen desteklenen tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 3/4 butterfly needles for blood collection | Becton Dickinson | 367251 | |
| Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml | Becton Dickinson | 366480 | |
| Sterile water for irrigation | Baxter | 07-09-64-070 | |
| Dextran 500 | Sigma | 31392 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S641 | |
| Dextrose | Ricca Chemical Company | RDCD0200 | |
| Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+ | Thermo Scientific | SH3002802 | |
| Ficoll solution | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401 | |
| 12 mm circular glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| 24-well plates | Corning Incorporated | 3524 | |
| Pooled Human Serum | Sigma | S7023 | |
| RPMI | Mediatech | 15-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007103 | |
| Human interleukin-8 | R&D Systems | 208-IL/CF | |
| MOPS | Sigma | M3183 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214 | |
| Propidium Iodide | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| SYTO9 | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| Saponin | Fluka Analytical | 47036 | |
| Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin | Life Technologies | L-32463 | |
| DAPI | Sigma | D8417 | |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | |
| Mouse anti-CD63 | Developmental Studies Hybridoma Bank | H5C6 | |
| Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit | Life Technologies | A20187 | |
| Hemacytometer Bright Line | Hausser Scientific | 1492 | |
| Forceps | EMS | 78320 | |
| Sorvall Legend RT + Centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 |
References
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils. Front Microbiol. 2, 77 (2011).
- Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes. Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).
- Seib, K. L., et al. Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay. Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).
- Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes. Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. J. Vis. Exp. (49), e2693 (2011).
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).
- Dorward, D. W. Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions. Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).
- Yang, L., et al. Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer. Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).
- Mueller, R. S., et al. Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization. J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).
- Shen, C., et al. Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).
- Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques. J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp.. (17), e745 (2008).
- Allen, L. A. Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils. Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).
- Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications. Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).
- Chow, O. A., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).
- Thulin, P., et al. Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection. PLoS Med. 3, e53 (2006).
- Kubica, M., et al. A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages. PLoS One. 3, (2008).
- Swords, W. E., et al. Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro. Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).
- Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells. Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).
- Martinez, A. N., et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).
- Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).
- Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages. J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).
- Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp. FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).
- Morse, S. A., Bartenstein, L. Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine. Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils. Cell Microbiol. , (2013).
- Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain. BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).
