कुल प्रोटीन निष्कर्षण और 2 डी जेल वैद्युतकणसंचलन तरीके के लिए<em> Burkholderia</em> प्रजाति
Summary
Burkholderia जीनस के सदस्य नैदानिक महत्व के रोगजनकों हैं. हम यांत्रिक विघटन, और बाद में प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए 2 डी जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग, कुल बैक्टीरियल प्रोटीन निकासी के लिए एक विधि का वर्णन.
Abstract
बैक्टीरियल प्रजातियों के intracellular प्रोटीन के स्तर की जांच के लिए इन जीवों से होने वाली बीमारी के रोगजनक तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ हम फॉस्फेट बफर खारा में ethylenediamine tetraacetic एसिड और phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड की उपस्थिति में ग्लास मनकों का उपयोग मैकेनिकल सेल पर आधारित Burkholderia प्रजातियों से प्रोटीन निष्कर्षण के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन. इस विधि अलग विकास की स्थिति के लिए, अलग Burkholderia प्रजातियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और यह अन्य जीवाणुओं की प्रोटिओमिक अध्ययन में इस्तेमाल के लिए संभावना उपयुक्त है. प्रोटीन निकासी के बाद, एक दो आयामी (2 डी) जेल वैद्युतकणसंचलन प्रोटिओमिक तकनीक इन जीवों की proteomes में वैश्विक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए वर्णित है. इस विधि आणविक वजन के आधार पर अलग होने के द्वारा पीछा प्रथम आयाम में ध्यान केंद्रित समविद्युतविभव द्वारा उनके isoelectric बिंदु के अनुसार प्रोटीन की जुदाई के होते हैं,दूसरा आयाम में acrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा. अलग हो प्रोटीन के दृश्य चांदी धुंधला द्वारा किया जाता है.
Introduction
जीनस Burkholderia 62 से अधिक प्रजातियों, आलों की एक विस्तृत श्रृंखला से अलग ग्राम नकारात्मक जीवों शामिल हैं, और यह दो मुख्य समूहों 1,2 में बांटा गया है. पहले क्लस्टर मानव, पशु और phytotrophic जीव भी शामिल है, और सबसे अधिक अध्ययन की वजह से उनके नैदानिक महत्व के लिए इस समूह की रोगजनक प्रजातियों पर ध्यान केंद्रित किया है. सबसे रोगजनक सदस्यों बी हैं pseudomallei और बी (क्रमशः melioidosis और ग्लैंडर्स कारण बनता है) mallei 3,4 और सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) और पुरानी granulomatous रोग (सीजीडी) में रोग का कारण जो अवसरवादी रोगजनकों 5 (Burkholderia cepacia जटिल, बीसीसी की 17 परिभाषित प्रजाति), 1. 30 से अधिक nonpathogenic प्रजातियों के साथ दूसरे क्लस्टर, पौधों के साथ या वातावरण के साथ जुड़े बैक्टीरिया भी शामिल है, और मेजबान 2 के लिए संभावित लाभदायक माना जाता है.
कई जटिलताओं fr उभरनेऐसी क्योंकि मामलों 6-9 से ज्यादातर में उन्मूलन के लिए कड़ी मेहनत कर रही एंटीबायोटिक दवाओं के लिए आंतरिक या अधिग्रहण प्रतिरोध के रोगियों, रोग के प्रसार और उपचार विफलता के बीच रोगज़नक़ के प्रसारण के रूप में Burkholderia जीनस के रोगजनक सदस्यों के साथ ओम जीवाणु संक्रमण. इसलिए, जीवाणु संक्रमण की स्थापना के लिए आधार का एक स्पष्ट समझ पाने के लिए इन जीवों से होने वाली बीमारी के उपचार के लिए महत्वपूर्ण है. संक्रमण की स्थापना में जानकारी हासिल करने के लिए, रोगजनन के साथ जुड़े जीवाणु घटकों पर व्यापक जांच की जरूरत है. प्रोटिओमिक दृष्टिकोण का उपयोग Burkholderia जीवों की प्रोटिओमिक विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित अध्ययन बैक्टीरियल रोगजनन में फंसा साथ ही उनके proteome में परिवर्तन 10-16 प्रोफाइल गया है कि प्रोटीन का वर्णन किया.
उच्च सान्द्र युक्त lysis बफर में sonication और फ्रीज thawed चक्र का उपयोग प्रोटीन निष्कर्षण तरीकोंयूरिया की entration, डिटर्जेंट और ampholytes साथ संयोजन में Thiourea Burkholderia प्रोटिओमिक पढ़ाई 10-13 में लागू किया गया है. यूरिया प्रोटीन विकृतीकरण के लिए काफी कुशल है, यह इस तरह (carbamylation प्रतिक्रिया) 17 कलाकृतियों के गठन, अमीनो एसिड समूहों के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं जो अमोनियम आइसोसाइनेट, साथ जलीय घोल में एक संतुलन स्थापित कर सकते हैं. इसलिए, यह cyanate मैला ढोने वालों के रूप में कार्य जो वाहक ampholytes, शामिल हैं और 37 डिग्री सेल्सियस 17 से ऊपर तापमान से बचने के लिए सिफारिश की है. इसके अलावा, प्रोटीन मात्रा का ठहराव के साथ lysis बफर के किसी भी रासायनिक हस्तक्षेप को रोकने के लिए, एक ही lysis बफर नमूने और मानकों में एक ही पृष्ठभूमि 10 इतनी है कि मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अन्य तरीके में गर्मी ऊष्मायन अवधि 17,18 साथ क्षारीय buffers और डिटर्जेंट का उपयोग शामिल है, लेकिन इन स्थितियों proteome में परिवर्तन उत्पन्न हो सकता है और कुछ डिटर्जेंट जनसंपर्क के साथ संगत नहीं हैंoteomics आवेदन बाद में डिटर्जेंट हटाने कदम 17,18 शामिल किए गए हैं जब तक.
पर्याप्त निकासी और मात्रा का ठहराव के बाद, प्रत्येक व्यक्ति प्रोटीन की वैश्विक प्रोटीन अभिव्यक्ति इस तरह के दो आयामी (2 डी) जेल वैद्युतकणसंचलन के रूप में प्रोटिओमिक दृष्टिकोण का उपयोग का अध्ययन किया जा सकता है. यह तकनीक पहले O'Farell 19 से वर्णित है और दूसरा आयाम में acrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्रथम आयाम में ध्यान केंद्रित समविद्युतविभव द्वारा उनके isoelectric बिंदु के अनुसार प्रोटीन की जुदाई, और फिर उनके आणविक वजन के हिसाब में शामिल किया गया था. इसकी वजह से संकल्प और संवेदनशीलता के लिए, इस तकनीक जटिल जैविक स्रोतों 19,20 से प्रोटीन का विश्लेषण और पहचान के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. इस जुदाई तकनीक बाद transcriptional संशोधनों या proteolytic प्रसंस्करण की वजह से प्रोटीन isoforms के समाधान के महान लाभ के साथ प्रोटीन केंद्रित दृष्टिकोण में वर्तमान में उपलब्ध है. मात्रात्मक परिवर्तनजेल में 20 की धुंधला के बाद इसी स्थान की तीव्रता की तुलना से पता लगाया जा सकता है. हालांकि, इस तकनीक बहुत बड़े प्रोटीन, झिल्ली प्रोटीन, बेहद बुनियादी और अम्लीय या हाइड्रोफोबिक प्रोटीन की पहचान के लिए अनुकूल है, और कुछ हद तक एक श्रमसाध्य और समय लेने वाली तकनीक 20 है नहीं है. और अधिक मजबूत और उद्देश्य हैं कि नई पेप्टाइड केंद्रित दृष्टिकोण (गैर जेल आधारित) उपलब्ध हो जाते हैं और इस तरह के (ICAT) 21 टैगिंग आइसोटोप कोडित आत्मीयता से सिस्टीन लेबलिंग, और एमिनो समूह के रूप में अंतर स्थिर आइसोटोप लेबलिंग तरीकों से मात्रात्मक तुलना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सापेक्ष और निरपेक्ष quantitation (iTRAQ) 22 के लिए आइसोटोप टैगिंग द्वारा लेबलिंग. एक एकल प्रोटिओमिक तकनीक का उपयोग अपर्याप्त जानकारी दे सकता है, इसलिए दो पूरक प्रोटिओमिक दृष्टिकोण का उपयोग proteome में सबसे पूरी तरह से आकलन करने में परिवर्तन के लिए आवश्यक है. फिर भी, 2 डी जेल वैद्युतकणसंचलन व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाता है और नियमित तौर पर क्वान के लिए लागू किया जा सकता हैविभिन्न जीवों में कई प्रोटीन की अभिव्यक्ति titative.
यहाँ हम अनुकूलित और अनुकूलित जीई हेल्थकेयर 2 डी वैद्युतकणसंचलन सिद्धांतों से और तरीकों हैंडबुक 80-6429-60AC 2004 (गया कि Burkholderia प्रजातियों के लिए एक पूरे सेल प्रोटीन निष्कर्षण और 2 डी जेल वैद्युतकणसंचलन प्रक्रियाओं का वर्णन www.amershambiosciences.com ). प्रोटीन निष्कर्षण 5 मिमी EDTA (ethylenediamine tetraacetic एसिड) और 1 मिमी PMSF (phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड युक्त) पीबीएस की उपस्थिति में ग्लास मोतियों के साथ एक मनका डिब्बा का उपयोग किया गया था. यह प्रक्रिया कम से कम गिरावट के साथ प्रोटीन की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है और जैसा कि पहले बताया 15,23,24 के रूप में प्रोटिओमिक दृष्टिकोण के लिए संशोधनीय है. 2 डी जेल वैद्युतकणसंचलन 24 सेमी लंबे समय से स्थिर पीएच 4-7 ढाल और प्रोटीन का उपयोग किया गया था उनके isoelectric बिंदु के अनुसार अलग हो गए थे. तो प्रोटीन उनके molec के अनुसार अलग हो गए थेएसडीएस polyacrylamide जेल से ular वजन. इसके अतिरिक्त, हम हाजिर प्रोटीन के दृश्य, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए संगत है कि एक चांदी दाग विधि के लिए एक चांदी धुंधला विधि का वर्णन किया. साथ में इन प्रक्रियाओं के रोगजनन में शामिल किया जा सकता है कि Burkholderia प्रजातियों से महत्वपूर्ण प्रोटीन की पहचान की अनुमति कर सकते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटीन की तैयारी के लिए एक विधि अच्छा reproducibility के साथ Burkholderia प्रोटीन का बहुमत निकाल सकते हैं कि वर्णित किया गया है. यह चित्र 1 में दिखाया के रूप में लेग या YEM शोरबा में उगाए वही जीवाणु संस्कृति का उपय…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एक (BV) के लिए ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय से छात्रवृत्ति और (डीपीएस) के लिए स्वास्थ्य अनुसंधान सिस्टिक फाइब्रोसिस कनाडा और कनाडा के संस्थानों से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. हम प्रोटोकॉल का प्रारंभिक तैयारी के लिए जैकलिन चुंग धन्यवाद.
Materials
| Reagents | |||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | Toxic, corrosive |
| Acetone | Fisher | A18-1 | Flammable |
| PBS Buffer | Bioscience | R028 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP118-500 | toxic |
| Glass beads (0.1 mm) | BioSpec Products | 11079101 | |
| Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) | VWR | 21009-342 | |
| MicroBCA protein extraction kit | Pierce | 23235 | |
| Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring | Fisher | 02-681-375 | |
| 2-D Clean-Up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| Urea | Invitrogen | 15505-050 | Irritant |
| CHAPS | Amersham Biosciences | 17-1314-01 | |
| Dithiothreitol (DTT) | MPBiomedical, LCC | 856126 | Irritant |
| Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm | Amersham Biosciences | 176002-46 | |
| Duracryl | Proteomic Solutions | 80-0148 | Very toxic, carcinogen |
| Ammonium persulfate | Fisher | BP179-100 | Flammable, toxic, corrosive |
| N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Invitrogen | 15524-010 | Flammable |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Acute toxicity, flammable |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Ethanol | Fisher | HC1100-1GL | Flammable, toxic |
| Acetic acid | Fisher | A491-212 | Flammable, corrosive |
| Glutaraldehyde | Fisher | G151-1 | Very toxic, corrosive, dangerous for the environment |
| Potassium tetrathionate | Sigma | P2926 | Irritant |
| Sodium acetate | EM Science | 7510 | |
| Silver nitrate | Sigma | 209139 | Corrosive, dangerous for the environment |
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | Toxic |
| Sodium thiosulfate | Sigma | S7026 | |
| Tris Base | EMD | 9230 | |
| Glycine | MPBiomedical, LCC | 808831 | |
| Glycerol | MPBiomedical, LCC | 800688 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Flammable, toxic, health hazard |
| Sodium carbonate anhydrous | EMD | SX0400-3 | Toxic |
| Mineral oil | ACROS | 415080010 | |
| Equipment | |||
| JA-20 ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 334831 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | 3110BX | |
| Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories | GE Healthcare | 80-6505-03 | www.amershambiosciences.com |
| Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system | GE Healthcare | 80-6485-27 | www.amershambiosciences.com |
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