Toplam Protein Ekstraksiyon ve 2-D Jel Elektroforez Yöntemleri<em> Burkholderia</em> Türler
Summary
Burkholderia cinsin üyeleri klinik önemi patojenlerdir. Bu, mekanik bozulma ve daha sonraki analiz için proteomik 2-D jel elektroforezi kullanılarak, toplam bakteri protein çıkarımı için bir yöntem tarif eder.
Abstract
Bakteri türlerinin hücre içi protein düzeylerinin araştırılması bu organizmaların neden olduğu hastalıkların patojenik mekanizmaların anlaşılması önem taşımaktadır. Burada, fosfat tamponlu tuzlu su içinde, etilendiamin tetraasetik asit ve fenilmetilsülfonil florit varlığında, cam boncuklar kullanılarak mekanik olarak parçalanması göre Burkholderia türünden protein çıkarımı için bir prosedür tarif eder. Bu yöntem, değişik büyüme koşulları için, farklı Burkholderia türler için kullanılabilir, ve bu diğer bakterilerin proteomik çalışmalarda kullanım için olası uygundur. Protein ekstre edilmesinden sonra, bir iki boyutlu (2-D) jel elektroforezi proteomik teknik bu organizmaların proteomlarda genel değişiklikler çalışma açıklanmaktadır. Bu yöntem, molekül ağırlığı bazında ayrılması ve ardından birinci boyutta izoelektrik odaklama ile izoelektrik noktasına göre proteinlerin ayrılması oluşurikinci boyutta akrilamid jel elektroforezi ile. Ayrılmış proteinlerin görselleştirilmesi gümüş boyama ile gerçekleştirilir.
Introduction
Genus Burkholderia fazla 62 türü, niş geniş bir izole edilen Gram negatif organizmaları içerir ve iki ana küme 1,2 ayrılmıştır. İlk küme insan, hayvan ve phytotrophic organizmaları içerir ve en çok çalışmalar nedeniyle klinik önemi bu grubun patojenik türler odaklanmıştır. En patojen üyeleri B'dir pseudomallei ve B. (sırasıyla Meliodosis ve ruam neden olur) mallei 3,4 ve kistik fibrozis (CF) ve kronik granülomatöz hastalık (ÇGD) hastalığa neden fırsatçı patojenler 5 (Burkholderia cepacia'nın kompleksi, BCC 17 tanımlanmış türler), 1. 30'dan fazla patojenik türlerle ikinci küme, bitkiler ya da ortamı ile ilişkili bakteri içerir ve ana 2 için potansiyel olarak yararlı olarak kabul edilmektedir.
Çok sayıda komplikasyonlar ortaya frBu tür durumlarda, çünkü 6-9 çoğunda ortadan kaldırmak için zor hale antibiyotiklere karşı içsel veya kazanılmış direnç hasta, hastalığın yayılmasını ve tedavi başarısızlık arasındaki patojenin iletimi gibi Burkholderia cinsin patojenik üyeleri ile om bakteriyel enfeksiyon. Bu nedenle, bakteriyel enfeksiyon kurulması için esas daha net bir anlayış kazanıyor bu organizmaların neden olduğu hastalıkların tedavisi için çok önemlidir. Enfeksiyon kurulması anlamak amacıyla, patogenez ile ilişkili bakteri bileşenleri üzerinde kapsamlı çalışmalara ihtiyaç vardır. Proteomik yaklaşımlar kullanılarak Burkholderia organizmaların proteomik analizi odaklanan çalışmalar bakteri patojeninde yanı sıra proteomu değişiklikler 10-16 profilleri edilmiş proteinler açıklanmıştır.
Yüksek konsantre ihtiva eden liziz tamponu içinde sonikasyon ve dondurularak çözülmüş döngüleri kullanılarak protein çıkarma yöntemleriüre entration, deterjan ve amfolitler ile kombinasyon halinde tioüre Burkholderia proteomik çalışmalar 10-13 uygulanmıştır. Üre protein denatürasyonu için oldukça etkili olsa da, bu şekilde (Karbamilleme reaksiyonu) 17 eserler oluşturan amino asit grupları ile reaksiyona girebilen amonyum izosiyanat, sulu çözelti içinde bir denge kurabilir. Bu nedenle, siyanat tarayıcılar olarak işlev taşıyıcı amfolitler içerir ve 37 ° C 17 üzerinde sıcaklıklar önlemek için önerilir. Ayrıca, protein miktarının eden liziz tamponu, herhangi bir kimyasal etkileşimi önlemek için, aynı liziz tamponu örnekler ve standartlar, aynı arka plan 10 sahiptir, böylece standart bir eğri oluşturmak için kullanılabilir. Diğer yöntemler ısı kuluçka dönemleri 17,18 ile alkalin tamponlar ve deterjan kullanımını içerir, ancak bu koşulların proteomun değişikliklere neden olabilir ve bazı deterjanlar pr ile uyumlu değildiroteomics uygulama müteakip deterjan kaldırma adımlar 17,18 dahil edilmedikçe.
, Yeterli bir özümleme ve miktar sonra her bir proteinin küresel protein ekspresyonu, iki boyutlu (2-D) jel elektroforezi gibi proteomik yaklaşımlar kullanılarak incelenebilir. Bu teknik, ilk olarak O'Farell 19 tarafından tanımlanan ve ikinci boyutta akrilamid jel elektroforezi ile birinci boyutta izoelektrik odaklama ile izoelektrik noktasına göre proteinlerin ayrılması, ve daha sonra, moleküler ağırlığa göre de oluşuyor. Nedeniyle çözünürlük ve hassasiyet için, bu teknik karmaşık biyolojik kaynaklardan 19,20 proteinlerin analizi ve tespiti için güçlü bir araçtır. Bu ayırma tekniği transkripsiyon sonrası modifikasyon veya proteolitik işlenmesi nedeniyle protein izoformlarını çözme büyük avantajı ile protein-merkezli yaklaşımlar şu anda kullanılabilir. Kantitatif değişikliklerJelin 20 lekelenmesiyle karşılık gelen nokta yoğunluğunu karşılaştırarak tespit edilebilir. Ancak, bu teknik çok büyük proteinler, zar proteinleri, oldukça bazik ve asidik ya da hidrofobik proteinlerin tanımlanması için uygun ve biraz zahmetli ve zaman alıcı bir teknik 20'dir değildir. Daha sağlam ve objektif olan yeni peptid-merkezli yaklaşımlar (non jel bazlı) kullanılabilir hale gelir ve bu (İcat) 21 etiketleme izotop kodlu afinite ile sistein etiketleme, ve amino grubu gibi diferansiyel izotop etiketleme yöntemleri ile Kantitatif karşılaştırma için kullanılabilir göreli ve mutlak kantitatif (iTRAQ) 22 için izotop etiketleme tarafından etiketleme. Tek proteomik tekniğin kullanılması yeterli bilgi verebilir ve bu nedenle, iki tamamlayıcı proteomik yaklaşımların kullanımı proteom en tam değerlendirmek değişiklikler için gereklidir. Bununla birlikte, 2-D jel elektroforezi yaygın olarak kullanılan ve rutin Quan için uygulanabilirfarklı organizmalar çeşitli proteinlerin ifadesini titative.
Burada adapte ve optimize GE Healthcare 2-D Elektroforez Esaslarına ve yöntemleri Handbook 80-6429-60AC 2004 (edildi Burkholderia türler için bir bütün hücre protein çıkarma ve 2-D jel elektroforezi prosedürlerini tarif www.amershambiosciences.com ). Protein ekstre etme, 5 mM EDTA (etilendiamin tetraasetik asit) ve 1 mM PMSF (fenilmetilsülfonil florür) içeren PBS varlığında, cam boncuklar ile bir boncuk çırpıcı kullanılarak gerçekleştirildi. Bu işlem en az bozulma ile proteinlerin ölçümü sağlar ve daha önce bildirilen 15,23,24 gibi proteomik yaklaşımlar için iyileştirilebilir. 2-D jel elektroforezi 24 cm uzun hareketsiz pH 4-7 gradyan ve proteinleri kullanılarak gerçekleştirildi izoelektrik noktasına göre ayrıldı. Sonra proteinler Molec göre ayrıldıSDS-poliakrilamid jel ile küler ağırlığı. Ayrıca, nokta proteinlerin görselleştirme ve kütle spektrometre analizi için uygun olan bir gümüş leke yöntemi için bir gümüş boyama yöntemi açıklanmıştır. Birlikte bu işlemler patojeneze dahil olabilir Burkholderia türlerinin önemli proteinlerin tanımlanmasını izin verebilirsiniz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Proteinlerin hazırlanması için bir yöntem ve iyi bir tekrarlanabilirlikle Burkholderia proteinlerin çoğunluğu elde olduğunu tarif edilmiştir. Bu, Şekil 1 'de gösterildiği gibi, LB veya YEM, çorba içinde yetişen aynı bakteri kültürü kullanarak farklı günlerde yapılan iki bağımsız preparatlar aynı protein profili elde edilmesi ile gösterilir. Ancak biz plakaları üzerinde büyüyen bakteriler için bu yöntemi test değil, ekstraksiyon, sıvı ortam içinde büyüm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma (BV) British Columbia Üniversitesi'nden öğrencilik ve (DPS) Sağlık Araştırma Kistik Fibrozis Kanada ve Kanada Enstitüleri hibe tarafından desteklenmiştir. Biz protokollerin ilk hazırlık için Jacqueline Chung teşekkür ederim.
Materials
| Reagents | |||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | Toxic, corrosive |
| Acetone | Fisher | A18-1 | Flammable |
| PBS Buffer | Bioscience | R028 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP118-500 | toxic |
| Glass beads (0.1 mm) | BioSpec Products | 11079101 | |
| Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) | VWR | 21009-342 | |
| MicroBCA protein extraction kit | Pierce | 23235 | |
| Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring | Fisher | 02-681-375 | |
| 2-D Clean-Up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| Urea | Invitrogen | 15505-050 | Irritant |
| CHAPS | Amersham Biosciences | 17-1314-01 | |
| Dithiothreitol (DTT) | MPBiomedical, LCC | 856126 | Irritant |
| Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm | Amersham Biosciences | 176002-46 | |
| Duracryl | Proteomic Solutions | 80-0148 | Very toxic, carcinogen |
| Ammonium persulfate | Fisher | BP179-100 | Flammable, toxic, corrosive |
| N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Invitrogen | 15524-010 | Flammable |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Acute toxicity, flammable |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Ethanol | Fisher | HC1100-1GL | Flammable, toxic |
| Acetic acid | Fisher | A491-212 | Flammable, corrosive |
| Glutaraldehyde | Fisher | G151-1 | Very toxic, corrosive, dangerous for the environment |
| Potassium tetrathionate | Sigma | P2926 | Irritant |
| Sodium acetate | EM Science | 7510 | |
| Silver nitrate | Sigma | 209139 | Corrosive, dangerous for the environment |
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | Toxic |
| Sodium thiosulfate | Sigma | S7026 | |
| Tris Base | EMD | 9230 | |
| Glycine | MPBiomedical, LCC | 808831 | |
| Glycerol | MPBiomedical, LCC | 800688 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Flammable, toxic, health hazard |
| Sodium carbonate anhydrous | EMD | SX0400-3 | Toxic |
| Mineral oil | ACROS | 415080010 | |
| Equipment | |||
| JA-20 ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 334831 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | 3110BX | |
| Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories | GE Healthcare | 80-6505-03 | www.amershambiosciences.com |
| Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system | GE Healthcare | 80-6485-27 | www.amershambiosciences.com |
References
- Drevinek, P., Mahenthiralingam, E. Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence. Clin. Microbiol. Infect. 16, 821-830 (2010).
- Suarez-Moreno, Z. R., et al. Common Features of Environmental and Potentially Beneficial Plant-Associated Burkholderia. Microb. Ecol. , (2011).
- Wiersinga, W. J., van der Poll, T., White, N. J., Day, N. P., Peacock, S. J. Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei. Nat. Rev. Microbiol. 4, 272-282 (2006).
- White, N. J. Melioidosis. Lancet. 361, 1715-1722 (2003).
- Mahenthiralingam, E., Urban, T. A., Goldberg, J. B. The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex. Nat. Rev. Microbiol. 3, 144-156 (2005).
- Speert, D. P., Henry, D., Vandamme, P., Corey, M., Mahenthiralingam, E. Epidemiology of Burkholderia cepacia complex in patients with cystic fibrosis. Canada. Emerg. Infect. Dis. 8, 181-187 (2002).
- Dance, D. A., Wuthiekanun, V., Chaowagul, W., White, N. J. The antimicrobial susceptibility of Pseudomonas pseudomallei. Emergence of resistance in vitro and during treatment. J. Antimicrob. Chemother. 24, 295-309 (1989).
- Thibault, F. M., Hernandez, E., Vidal, D. R., Girardet, M., Cavallo, J. D. Antibiotic susceptibility of 65 isolates of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei to 35 antimicrobial agents. J. Antimicrob. Chemother. 54, 1134-1138 (2004).
- Govan, J. R. W., et al. Evidence for transmission of Pseudomonas cepacia by social contact in cystic fibrosis. Lancet. 342, 15-19 (1993).
- Thongboonkerd, V., et al. Altered proteome in Burkholderia pseudomallei rpoE operon knockout mutant: insights into mechanisms of rpoE operon in stress tolerance, survival, and virulence. J. Proteome. Res. 6, 1334-1341 (2007).
- Park, K. H., Lipuma, J. J., Lubman, D. M. Comparative proteomic analysis of B. cenocepacia using two-dimensional liquid separations coupled with mass spectrometry. Anal Chim. Acta. 592, 91-100 (2007).
- Wongtrakoongate, P., Mongkoldhumrongkul, N., Chaijan, S., Kamchonwongpaisan, S., Tungpradabkul, S. Comparative proteomic profiles and the potential markers between Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Mol. Cell Probes. 21, 81-91 (2007).
- Harding, S. V., et al. The identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei. Vaccine. 25, 2664-2672 (2007).
- Madeira, A., Santos, P. M., Coutinho, C. P., Pinto-de-Oliveira, A., Sa-Correia, I. Quantitative proteomics (2-D DIGE) reveals molecular strategies employed by Burkholderia cenocepacia to adapt to the airways of cystic fibrosis patients under antimicrobial therapy. Proteomics. 11, 1313-1328 (2011).
- Zlosnik, J. E. A., Speert, D. P. The Role of Mucoidy in Virulence of Bacteria from the Burkholderia cepacia Complex: A Systematic Proteomic and Transcriptomic Analysis. J. Infect. Dis. 202, 770-781 (2010).
- Riedel, K., Carranza, P., Gehrig, P., Potthast, F., Eberl, L. Towards the proteome of Burkholderia cenocepacia H111: setting up a 2-DE reference map. Proteomics. 6, 207-216 (2006).
- Weiss, W., Gorg, A. Sample solublization buffers for two-dimensional electrophoresis. Methods Mol. Biol. 424, 35-42 (2008).
- von der Haar, T. Optimized protein extraction for quantitative proteomics of yeasts. PLoS One. 2, e1078 (2007).
- O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250, 4007-4021 (1975).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).
- Gygi, S. P., Rist, B., Griffin, T. J., Eng, J., Aebersold, R. Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags. J. Proteome Res. 1, 47-54 (2002).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol. Cell Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
- Velapatiño, B., Limmathurotsakul, D., Peacock, S. J., Speert, D. P. Identification of differentially expressed proteins from Burkholderia pseudomallei isolated during primary and relapsing melioidosis. Microbes. Infect. 14, 335-340 (2012).
- Chung, J. W., Speert, D. P. Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host. Microbiology. 153, 206-214 (2007).
- Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. Public health assessment of potential biological terrorism agents. Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).
- Thon, J. N., et al. Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches. Transfusion. 48, 425-435 (2008).
- Wu, T. In New and Emerging Proteomic Techniques. Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).
- Lopez, M. F., et al. A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling. Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).
