유전자 탐구하는 종피 침구 분석<em&gt; 체외</em&gt; 어떻게 배젖 컨트롤 종자 발아에<em&gt; 애기 장대</em

요약

우리는 애기 장대 씨앗에서 씨앗 코트 침구 분석 (SCBA)를 조립하는 절차를 제시한다. SCBA는 유전자와 체외에서 탐색 할 수있는 강력한 도구가 될 수 있도록 표시 방식 휴면 종자의 빛 신호에 대한 응답으로 배유 컨트롤 종자 발아. SCBA는 배유가 배아의 성장에 영향을 미칠 것으로 의심되는 모든 상황에서 적용 할 수있는 원리입니다.

초록

애기 장대의 배유는 성숙한 배아를 둘러싸고 휴면 종자의 발아 또는 (FR)까지 붉은 빛 펄스에 의해 조사 nondormant 씨의 방지에 필수적인 역할을하는 하나의 세포 층으로 구성되어 있습니다. 더 배유에 의해 가해지는 발아 억압적인 활동의 기초가되는 분자 유전 학적 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위해, "종피 침구"분석 (SCBA)를 고안했다. SCBA 물리적 씨앗 코트의 기본 레이어에 태아의 성장을 확인할 수 있도록 해줍니다 씨앗에서 씨앗 코트와 배아를 분리하는 절개 절차입니다. 현저하게, SCBA 종자 휴면 종자 발아의 FR 의존 제어의 맥락에서 종피의 발아 억압 활동을 재구성한다. SCBA는 휴면 nondormant 및 유전자 변형 종자 코트와 배아 재료, 발아를 제어하는​​ 유전자 경로의 조합 사용이 가능하며 특히 영업 이익 때문에배유 및 배아 erating 해부 할 수 있습니다. 여기서 세부 SCBA 조립 절차를 우리.

서론

애기 성숙한 종자, 종피가 종피, 산모 원 죽은 조직의 외부 층과, 배유, 직접 ^{한 배아를} 둘러싸고 살아있는 조직의 단일 셀 층으로 구성된다. 배유 및 배아는 별도의 수정 이벤트에서 파생 된 : 배아는 하나의 임산부와 한 아버지의 게놈 ² 배체 조직 반면 배유는 임산부와 한 아버지의 게놈 2 개 배체 조직이다.

전통적 배유에 할당 된 주 기능은 영양 조직의 점이다. 그러나, 배유 또한 종자 발아를 제어하기위한 중심적인 역할을하는 것이 점차 명백 해지고있다. 이 개념은, 수면의 경우 새로 생성 된 씨앗에 의해 전시 특성 첫 번째 명백하게되었다. 휴면 종자 발아 유리한 조건의 존재에도 불​​구하고 발아하지 못한다. 씨앗은 숙성 기간 후 자신의 수면을 잃고 nondorman가유리한 발아 조건에 노출되었을 때 t, 즉, 그들은 발아합니다. 이 모델 식물 애기 장대를 포함한 많은 식물 종에서, 종피는 절대적으로 종피 제거 배아의 성장과 ^{3,4 녹색화를} 트리거 이후 휴면 종자의 발아를 방지하기 위해 필요합니다. 애기 장대에서 Bethke는 외. 발아 배유 ^5를 둘러싼 배젖을 유지하면서 종피를 ....

프로토콜

SCBA가 조립되면, 배아의 성장은 며칠에 걸쳐 모니터링된다. 따라서 SCBA의 시드 절개 과정과 조립하기 전에, 하나는 배아 성장 종피 물질의 효과의 적절한 평가를 방지 할 수있는 미래의 오염을 피하기 위하여 종자를 살균 할 필요가있다.

1. 종자 소독

1. 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 성숙하고 건조 애기 씨의 50 μl를 넣고 70 % 에탄올 용액을 제조.
2. 종자를 함유하는 마이크로 원심 분리 튜브에 70 % 에탄올 용액 1 ㎖를 추가하고 vortexer를 1,200 rpm에서 10 분 동안 실온에서 흔들.
3. 3 초 동안 원심 분리기의 microcentrifuge 관은 4,000 XG에서 튜브의 바닥에 씨앗을 집중한다.
4. 정중 microcentrifuge 관의 하단에 씨앗을 떠나기 진공 흡인 팁을 이용하여 70 % 에탄올 용액을 대기음.
5. t에 멸균 증류수 1 ㎖를 추가 그는 microcentrifuge 관은 여전히​​ 씨앗을 포함.
6. 1,200 rpm에서 10 분 동안 상온에서 흔들어.
7. 3 초 동안 원심 분리기의 microcentrifuge 관은 4,000 XG에서 튜브의 바....

결과

이전 작업은 GA를 합성 할 수없는 돌연변이 종자 씨앗 ^{(11, 12)에서} 높은 ABA 축적의 결과로 발아 할 수 없음을 보여 주었다. 그것의 제거가 배아의 성장 ^(13)을 트리거하기 때문에, 발아 할 수없는이 씨 외투가 필요합니다. 이 강력 GA를 합성 할 수없는 종자의 배유가 배아의 성장을 차단하는 ABA를 발표합니다 지적했다. 따라서 우리는 GA와 ABA를 합성 할 수없는 씨앗 코트와 달리 SCBA에서 배아의 성장을 차단하는 GA를 합성 할 씨앗 코트가없는 것으로 예상된다. 여기에 우리가 사용 GA1-21 (솔크 삽입 라인 Salk_109115) GA 생합성 ¹⁴ GA1에서 (SALK_109115 삽입 라인 (필수적이다 ENT-copalyl 인산 합성 효소를 코딩하는 GA1 유전자 (가입시 AT4G02780을) 중단 T-DNA 삽입을 들고 돌연변이 종자 골 생태형)는 솔크 신호 데이터베이스 ^.......

토론

여기에 설명 된 씨앗 코트 침구 분석 (SCBA) 절차는 원칙적으로 애기 장대 종자 발아가 차단 (또는 지연)와 배젖이 체포를 구현하기 위해 의심되는 모든 상황에 적용 할 수있다. 후자 종피 (종피 및 배유)를 제거하고 배아 종피 둘러싸여 때 상대 속도 배아 성장이 진행이 관찰한다는 관찰에 의해 입증 될 수있다. 발아는 특정 환경 물리적 매개 변수 (예를 들면 물 전위 또는 가벼운 질) 또는 특정 유전 적 배경에서 (GA1 돌연변이와 같이 GA 합성의 예 부재, 그림 3 참조)에 대한 응답으로 차단 될 수 있습니다.

씨앗 코트와 SCBA에 사용되는 배아의 수에 관한 더 일반적인 규칙은 없습니다. 이것은 시드 배치 (및 특히 그것의 선도)에 따라 실험의 분류가 수행 될. 그것은 adjus하는 것이 중요합니다매일 시드 코트의 침대에 배아의 성장을 모니터링하여 각각의 특정한 경우에 대한 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Thermomixer Comfort	Eppendorf AG	5355 000.011	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Vacusafe Comfort	INTEGRA Biosciences AG	158 310	Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland
Petri dish plate (100 mm x 20 mm)	Greiner Bio-One GmbH	664 102	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Murashige and Skoog	Sigma-Aldrich	M5524	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, 미국
MES	Sigma-Aldrich	M3671	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
한천 (식물 한천)	Duchefa Biochemie BV	P1001	Duchefa Biochemie, 하를렘, 네덜란드
Dumont 집게 #5	Fine Science Tools GmbH	11251-10	Fine Science Tools GmbH, 하이델베르크 독일
주사기 바늘	BD Micro-Fine	324827	BD, Franklin Lakes, NJ USA
나일론 메쉬(SEFAR NYTEX)	SEFAR AG	03-50/31	Sefar AG, 하이덴, 스위스
성장 챔버	CLF 식물 기후	Percival I-30BLLX	CLF plant Climatics, Wertingen,
GermanyPaclobutrazol	Sigma-Aldrich	46046	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, 미국