זיהוי של חיידקים פעילים מטבולית במעיים של Generalist<em> Spodoptera littoralis</em> באמצעות איזוטופ יציב DNA גשוש שימוש<sup> 13</sup> C-גלוקוז
Summary
קהילת החיידקים הפעילה הקשורים לבטן של littoralis Spodoptera, נקבעה על ידי יציב-חיטוט-איזוטופ (SIP) מצמידים את pyrosequencing. השימוש במתודולוגיה זו, זיהוי של מיני חיידקים הפעילים מטבולית בתוך הקהילה נעשה ברזולוציה גבוהה ודיוק.
Abstract
אומץ של רוב החרקים הם מיושבים על ידי קהילות מורכבות של חיידקי nonpathogenic סימביוטיים. בתוך קהילות של חיידקים כאלה ניתן לזהות מיני commensal או חיידקי mutualistic. אלה האחרונים, נצפו לשרת פונקציות רבות לחרקים, כלומר מסייעים ברבייה חרקים 1, לחיזוק התגובה החיסונית 2, ייצור פרומון 3, כמו גם תזונה, כוללים הסינתזה של חומצות אמינו חיוניות 4, בין יתר.
בשל החשיבות של עמותות אלה, מאמצים רבים נעשו כדי לאפיין את הקהילות עד לחברים הבודדים. עם זאת, רוב המאמצים אלה היו מבוססים גם על שיטות גידול או הסתמך על הדור של שברי גני 16S rRNA שהיו רצף לזיהוי סופי. למרבה הצער, גישות אלה זוהו רק מיני חיידקים הנמצאים במעי ולא סיפקו informatיון על הפעילות המטבולית של מיקרואורגניזמים.
כדי לאפיין את מיני חיידקים הפעילים מטבולית במעיים של חרקים, השתמשנו איזוטופ היציב חיטוט (SIP) in vivo העסקת 13 C-גלוקוז כמצע אוניברסלי. זוהי טכניקה נטולת תרבות מבטיחה המאפשרת ההצמדה של phylogenies חיידקים לפעילות המטבולית שלהם בפרט. זה אפשרי על ידי מעקב אטומים ממצעים יציבים, איזוטופ שכותרתו לתוך סמנים ביולוגיים של חיידקים, כגון DNA ו-RNA 5. שילוב של 13 C איזוטופים לתוך ה-DNA מגביר את הצפיפות של ה-DNA שכותרתו בהשוואה לללא תווית (12 C) אחד. בסופו של הדבר, ה-DNA שהכותרת-C 13 או RNA הוא מופרדת על ידי ultracentrifugation צפיפות שיפוע מאחד 6 דומים 12 C-ללא התווית. הניתוח מולקולרי הבא של isotopomers חומצות הגרעין המופרד מספק את הקשר בין פעילות וזהות המטבולית של המינים.
כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול המשמש כדי לאפיין את החיידקים הפעילים מטבולית במעיים של חרקים generalist (מערכת המודל שלנו), littoralis Spodoptera (פרפרים, Noctuidae). הניתוח פילוגנטי של ה-DNA נעשה באמצעות pyrosequencing, אשר אפשר ברזולוציה גבוהה ודיוק בזיהוי של קהילת חיידקי מעי חרק. כמצע עיקרי, 13 גלוקוז שכותרת-C שימש בניסויים. המצע היה נמאס לחרקים באמצעות תזונה מלאכותית.
Introduction
עמותות סימביוטיים חרקים בקטריאלי ידועים מספר רב של מיני חרקים 7. בעמותות סימביוטיים אלה, מיקרואורגניזמים ממלאים תפקידים חשובים בצמיחה וההתפתחות של חרקים. חיידקים הוכחו לתרום לרביית חרקים 1, פרומון ביוסינתזה 3, תזונה, כוללים הסינתזה של חומצות אמינו חיוניות 4, ועיכול של מזון שאינו נגיש למארח. למרות המגוון העצום של עמותות בטן בקטריאלי, הרבה פחות ידוע על התפקיד הפונקציונלי שהם משחקים לטובתו של החרק. רק במקרה של הטרמיטים, העיכול הסימביוטי של lignocellulose בוצע על ידי פרוקריוטים, פרוטוזואה, ופטריות, נחקר באופן נרחב 8,9. בניגוד לכך, מעט מאוד ידוע על הקשר הסימביוטי ההווה במעיים של חרקים generalist כלומר leafworm הכותנה, Spodoptera littoralis. יתר על כן, בשל השינוי התכוף שלהם של מארחים צמח, כלליהחרקים ist וקהילות הבטן הקשורות החיידקים שלהם באופן קבוע חשופים לאתגרים חדשים הקשורים להרגלי האכילה שלהם לצרוך צמחים עם שפע של פיטוכימיקלים. לצד זה, את סביבת המעי בlepidopterans, מייצגת כשלעצמה סביבה קשה לצמיחה של חיידקים בגלל החומציות במעיים הגבוהה 10. במיוחד במקרה של ס ' littoralis, זה נע בין 10.5 במעי הקדמי, CA. 9 בmidgut לPH כמעט 7 ב11 המעי האחורי. מצד השני, קהילת החיידקים הקשורים לבטנו של ס ' littoralis הוא פשוט. טאנג, Freitak, et al 12. דיווח מרבי של 36 phylotypes השייך לסך של 7 מיני חיידקים שונים כמו רק לחברי קהילת חיידקים הקשורים לחרק הזה. חוץ מזה, אין הליך גידול מסובך דרוש להתפתחות החרקים במעבדה. יתר על כן, זה ומחזור החיים הקצר של החרק להקל רב גרםמחקרי enerational, הופך מין זה למערכת מודל אידיאלית לחקר אינטראקציות בטן חיידק.
עם כניסתו של טכנולוגיות רצף המבוססות על ה-PCR, מספר מחקרים העוסקים בהביוטה בטן של כמה אורגניזמים (בני אדם כלומר, חרקים, או יצורים ימיים) גדל. יתר על כן, התוצאות הן עצמאיות מבידוד והטיפוח של חיידקי המעיים טיפחו כמו בעבר. כמעט 99% מחיידקים אינם ראויים לעיבוד חקלאיים והסימולציה של התנאים הסביבתיים ששררו במעיים קשה 12. באמצעות PCR, שברי גן 16S rRNA (סמן בשימוש נרחב פילוגנטי גנים בין חיידקים) יכולים להיות מוגבר באופן סלקטיבי מתבנית ה-DNA מעורבת של קהילות חיידקי מעיים, רצף, ומשובט. בעזרת מידע זה, המשתמש יכול לזהות את מיני חיידקים לאחר אחזור מידע רצף ממאגרי מידע ציבורי 13,14. עם זאת, רצף מתקרב לתאר חיידקיםקהילות יישארו מספיק בשל חוסר המידע על תרומת חילוף חומרים הפנימית של המינים הבודדים בתוך הקהילה.
היציב-איזוטופ חיטוט (SIP) הוא טכניקה נטולת תרבות מבטיחה. הוא משמש לעתים קרובות במיקרוביולוגיה סביבתית לנתח phylogenies חיידקים קשורים לפעילות חילוף חומרים מסוימת. זו מושגת על ידי מעקב אטומים ממצעים יציבים, איזוטופ שכותרתו לתוך סמנים ביולוגיים של חיידקים, כגון חומצות המופקים מפוספוליפידים שומן, DNA, RNA ו5. כאשר שוקלים חומצות גרעין, מתודולוגיה מבוססת על הפרדת 13 DNA שכותרת-C או RNA מ-DNA ללא תווית ידי ultracentrifugation צפיפות שיפוע 6. בשל קשר ישיר זה בין תווית ה-DNA ואת פעילות חילוף חומרים, ניתוח מולקולרי במורד הזרם של חומצות הגרעין מזהה את המינים ומספק מידע על פעילות המטבולית. יתר על כן, שילוב של ה-DNA-SIP וpyrosequencing כפי שיושם על ידיPilloni, פון נצר, et al. 15, מאפשר זיהוי פשוט ורגיש במיוחד של מיני חיידקים המצויים בחלק ה-DNA הכבד 13 כותרת C. עד עכשיו, בטכניקה זו יושמה כדי לתאר את קהילות חיידקים מעורבות בתהליכי biogeochemical בקרקע בתנאים אנאירוביים ואירוביים 16,17 18,19. חוץ מזה של השימוש במדעי הסביבה, הטכניקה יושמה במדעי רפואה כפי שדווחה על ידי רייכרט, et al. 5, שתיאר את הפעילות המטבולית של קבוצות פילוגנטי שונות של חיידקי מעיים האנושיים בתגובה לפחמימות nondigestible.
כאן אנו משתמשים 13 C-גלוקוז ל'תווית 'את ה-DNA של מיני חיידקים הפעילים מטבולית במעיים. גלוקוז הוא סוכר מנוצל על ידי רוב מיני חיידקים לאורך השביל הנרחב Entner-Doudoroff (ED), אם כי ידועים חריגים 20. זהמצדיק את השימוש ב13 C-גלוקוז כמו בדיקה חילוף חומרים אמינה המספקת קשר בין מטבוליטים של עניין ומקור פחמן לאורך מסלולים הוקמו. בהתאם לשאלה המדעית, מצעים אחרים, כלומר 13 C-מתאן, 13 CO 2, או צמחים שהועלו תחת אווירת 13 CO 2, ניתן להשתמש בם כדי לטפל בפעילות המטבולית.
בשלב זה, אנו מציגים הפרוטוקול מיושם באפיון מטבולים של קהילת חיידקי המעיים של חרקים generalist, כלומר ס littoralis (פרפרים, Noctuidae). יתר על כן, הטכניקה הייתה מצמידים את pyrosequencing, אשר בתורו מאפשר זיהוי של קהילת חיידקי מעי חרק עם רזולוציה גבוהה ודיוק. כמצע העיקרי, 13 גלוקוז שכותרת-C נוצל במהלך הניסויים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הבטן של רוב החרקים נמלי קהילת חיידקים עשירה ומורכבת, בדרך כלל 10 7 -10 9 תאים פרוקריוטים להגיש שם, מספרם עולים בתאים של המארח ברוב המקרים. לכן, תחושת הבטן של החרק היא "נקודה חמה" לפעילות של חיידקים מגוונים, המייצגים היבטים שונים של מערכות יחסים של חיידקים, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לאנג'ליקה ברג לסיוע מעבדה. עבודה זו נתמכה ומומנה על ידי אגודת מקס פלנק ובית הספר ליינה למיקרוביאלית תקשורת (JSMC).
Materials
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
References
- Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).
- Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H. Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore. Proc. Biol. Sci. 276, 2617-2624 (2009).
- Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. A Note: Gut bacteria produce components of a locust cohesion pheromone. J. Appl. Microbiol. 92, 759-763 (2002).
- Douglas, A. E. Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their symbiotic bacteria Buchnera. Annu. Rev. Entomol. 43, 17-37 (1998).
- Reichardt, N., Barclay, A. R., Weaver, L. T., Morrison, D. J. Use of stable isotopes to measure the metabolic activity of the human intestinal microbiota. Appl. Environ. Microbiol. 77, 8009-8014 (2011).
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing – linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
- Gil, R., Latorre, A., Moya, A. Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics. Environ. Microbiol. 6, 1109-1122 (2004).
- Brune, A., VH, R. e. s. h., Cardé, R. T. . Encyclopedia of Insects. , 1132 (2005).
- Breznak, J. A., Brune, A. Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites. Annu. Rev. Entomol. 39, 453-487 (1994).
- Broderick, N. A., Raffa, K. F., Goodman, R. M., Handelsman, J. Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods. Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300 (2004).
- Funke, M., et al. Rapid hydrolysis of quorum-sensing molecules in the gut of lepidopteran larvae. Chembiochem. 9, 1953-1959 (2008).
- Tang, X. S., et al. Complexity and variability of gut commensal microbiota in polyphagous lepidopteran larvae. PloS One. 7, (2012).
- Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59, 143-169 (1995).
- Olsen, G. J., Lane, D. J., Giovannoni, S. J., Pace, N. R., Stahl, D. A. Microbial ecology and evolution – a ribosomal-rna approach. Annu. Rev. Microbiol. 40, 337-365 (1986).
- Pilloni, G., von Netzer, F., Engel, M., Lueders, T. Electron acceptor-dependent identification of key anaerobic toluene degraders at a tar-oil-contaminated aquifer by Pyro-SIP. FEMS Microbiol. Ecol. 78, 165-175 (2011).
- Lu, Y. H., Conrad, R. In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere. Science. 309, 1088-1090 (2005).
- Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. R., Murrell, J. C. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology. Nature. 403, 646-649 (2000).
- Lueders, T., Pommerenke, B., Friedrich, M. W. Stable-isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits: Syntrophic propionate oxidation in flooded soil. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5778-5786 (2004).
- Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation. ISME J. 1, 643-653 (2007).
- Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species. J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).
- Dunford, E. A., Neufeld, J. D. DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP). J. Vis. Exp. (42), (2010).
- Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation. Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).
- Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients. Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).
- Ishak, H. D., et al. Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing. Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).
- Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment. Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5 (2012).
- Dillon, R. J., Dillon, V. M. The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions. Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).
- Neufeld, J. D., et al. DNA stable-isotope probing. Nat. Protoc. 2, 860-866 (2007).
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing – linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
