Enteric bakterielle Invasion von intestinalen Epithelzellen<em> In Vitro</em> Ist erheblich verstärkt unter Verwendung eines vertikalen Diffusion Chamber Modell
Summary
Durchführen Zellkultur-Assays zur Untersuchung von bakteriellen Adhäsion und Invasion unter aeroben Bedingungen in der Regel nicht repräsentativ für die<em> In vivo</em> Umwelt. Eine Vertikale Diffusion Chamber Modell ermöglicht Untersuchung der Wechselwirkungen des menschlichen Erreger<em> Campylobacter jejuni</em> Mit intestinalen Epithelzellen unter mehr<em> In vivo</em>-Ähnlichen Bedingungen, was zu einer erhöhten bakteriellen Invasion.
Abstract
Die Wechselwirkungen von bakteriellen Erregern mit Wirtszellen wurden ausgiebig mit in vitro Zellkultur Methoden untersucht. Jedoch als solche Zellkultur-Assays unter aeroben Bedingungen durchgeführt wird, diese in-vitro-Modellen nicht genau den in-vivo-Umgebung, wobei der Wirt-Pathogen-Interaktionen stattfinden. Wir haben ein in vitro-Modell der Infektion, die Kokultur von Bakterien und Wirtszellen ermöglicht unter verschiedenen mittel-und Gas-Bedingungen entwickelt. Die vertikale Diffusion Chamber (VDC) Modell imitiert die Bedingungen im menschlichen Darm, wo Bakterien unter Bedingungen mit sehr niedrigen Sauerstoff während Gewebe sein wird mit Sauerstoff aus dem Blutkreislauf zugeführt werden. Platzieren polarisiert intestinalen Epithelzellen (IEC) in Monoschichten Snapwell Einsätze in einer VDC gewachsen erstellt separate apikalen und basolateralen Kompartimenten. Basolateralen Kompartiment mit Zellkulturmedium gefüllt, verschlossen und mit Sauerstoff durchströmt während die apikale Fach mit Brühe gefüllt ist, offen gehalten und inkubiert unter mikroaeroben Bedingungen. Sowohl Caco-2 und T84 IECs können im VDC unter diesen Bedingungen ohne ersichtlichen nachteilige Auswirkungen auf das Überleben der Zelle oder Monoschicht Integrität beibehalten. Cokultivierung Experimente mit verschiedenen C durchgeführt jejuni Wildtyp-Stämme und unterschiedliche IEC Linien in der VDC-Modell mit mikroaeroben Bedingungen in der apikalen Kammer reproduzierbar in einer Erhöhung der Anzahl der Interaktion (nahezu 10-fach) und intrazelluläre (fast 100-fach) Bakterien gegenüber aeroben Kulturbedingungen führen 1. Das Umfeld, in dem VDC-Modell erstellt mehr imitiert die Umwelt durch C. angetroffen jejuni im menschlichen Darm und unterstreicht die Bedeutung der Durchführung in vitro Infektion Assays unter Bedingungen, die stärker die in vivo Realität zu imitieren. Wir schlagen vor, dass die Verwendung des VDC-Modell ermöglicht neue Interpretationen der Wechselwirkungen wettenween bakterielle Erreger und Wirtszellen.
Introduction
Die Wechselwirkungen von bakteriellen Erregern mit Wirtszellen wurden ausgiebig mit in vitro Zellkultur Methoden untersucht. Mit solchen Zellkulturassays, bakterielle Adhäsion an Wirtszellen, die Identifizierung von Wirtszellen Rezeptoren Wirtszelle Signalwege und Bakterienbefall von Wirtszellen sind alle im Detail untersucht, was in vielen wichtige Beobachtungen. Jedoch sind solche Zellkultur-Assays werden unter aeroben Bedingungen, die nicht repräsentativ für die in vivo-Umgebung kann durchgeführt. Eine wesentliche Einschränkung der in-vitro-Modellen verwendet werden, um Magen-Darm-Infektionen zu studieren, ist, dass die Kultur Bedingungen, einschließlich hoher Sauerstoffgehalt im Allgemeinen bevorzugen eukaryotischen Zelle Überleben. Allerdings Bedingungen im Darmlumen wird fast anaerob. Darmpathogene in sehr sauerstoffarmen Umgebung auszudrücken Virulenz Gene, deren Expression Änderungen unter aeroben Bedingungen 2. Als solche erhaltenen Daten unter Verwendung von Standard Zellkulturmodellen may geben eine ungenaue Angabe von bakteriellen Interaktionen mit Wirtszellen.
Campylobacter jejuni ist der führende Erreger der bakteriellen akuten Gastroenteritis weltweit, mit Symptomen, die reichen von leichtem Durchfall bis zu schweren entzündlichen Darmentzündungen. Die meisten C. jejuni Infektionen führen unkomplizierten Gastroenteritis, aber C. jejuni ist auch der am häufigsten identifizierte Erreger in peripheren Neuropathien einschließlich Guillain-Barré-Syndrom (GBS). In Großbritannien wird geschätzt, dass es mehr als 500.000 Fälle von Enteritis verursacht durch C. jejuni-Infektion jedes Jahr mit einem prognostizierten Kosten für die britische Wirtschaft von £ 580.000.000. In den Entwicklungsländern, C. jejuni ist eine der Hauptursachen für die Sterblichkeit bei Kindern. Trotz der unbestrittenen Bedeutung von Campylobacter-Infektion und Jahrzehnten der Forschung, einschließlich einer gründlichen Genomik-basierte Analyse, C. jejuni Pathogenese ist noch weitgehend understood, im Gegensatz zu anderen enterischen Pathogenen wie Salmonella, Escherichia coli, Shigella und Vibrio cholerae. Der Mangel an einem geeigneten Tiermodell kleine ist ein wesentlicher Grund für diese 3. Auch die weit in vitro Infektion verwendeten Modelle sind ungeeignet für das Studium mikroaerophilen C. jejuni als für andere Darmpathogene, die fakultativ anaerob sind. Während C. jejuni als invasive Erreger, die Mechanismen von C. anerkannt jejuni Invasion von intestinalen Epithelzellen (IECs) sind noch unklar 4,5. C. jejuni Invasion hat sich gezeigt, dass in Abhängigkeit von entweder Mikrofilamente, Mikrotubuli, eine Kombination von beiden oder keiner 5. Die Verwirrung in diesem Bereich ist sehr wahrscheinlich auf die Verwendung ungeeigneter in vitro Assay-Bedingungen.
Eine Reihe von verschiedenen Zellkultur-Assays verwendet wurden, um die Wechselwirkungen zu untersuchen C. jejunimit Wirtszellen. Caco-2-6 wurden 407 INT 7 und 8 T84 Zelllinien alle verwendet worden, um die Adhäsion und Invasion Fähigkeiten verschiedener C. studieren jejuni Stämme. Jedoch sind die Werte der bakteriellen Adhäsion und Invasion von C. jejuni mit IECs sind dramatisch niedriger als bei anderen Darmpathogene 9. Die Co-Kultivierung von C. jejuni mit IECs wird normalerweise in einem CO 2-Inkubator unter Bedingungen nahe dem atmosphärischen Sauerstoff durchgeführt wird, erforderlich für das Überleben der IECs. C. jejuni Genexpression wird sehr unterschiedlich in der sauerstoffarmen Umgebung der Darmlumen gegenüber Luftsauerstoff Bedingungen.
Die Verwendung einer Vertikal Diffusionskammer (VDC-System) entwickelt worden, die erlaubt die Co-Kultivierung von Bakterien und Wirtszellen unter anderen Medium und Gas Bedingungen 1,10,11. Dieses System ahmt die Bedingungen im menschlichen Darm, wo Bakterien un wirdder Bedingungen des sehr niedrigen Sauerstoff während Gewebe wird mit Sauerstoff aus dem Blutkreislauf zugeführt werden. Polarized IEC Monoschichten in speziellen 0,4 um Filter angebaut wurden in einen VDC Schaffung einer apikalen und basolateralen Kammer, die einzeln mit bakteriellen Brühe und Zellkulturmedium bzw. (Abbildung 1) wurden gefüllt ist. Das VDC wurde in die Variable Atmosphäre Inkubator mit 85% N 2, 5% O 2 und 10% CO 2 bei 37 ° C, was optimale Bedingungen für C. platziert jejuni. Der apikale Kammer offen gelassen wurde und ausgesetzt, um die Atmosphäre innerhalb des mikroaerobe variable Atmosphäre Inkubator, während der abgedichtete basolateralen Kammer mit Sauerstoff durch konstante Verabreichung von 5% CO 2/95% O 2-Gasgemisch mit einem Auslaßrohr die Ansammlung von Druck zugeführt . Caco-2-Zell-Überleben und die Monoschicht Integrität unter diesen Bedingungen wurden durch die Überwachung der transepithelialen ele bestätigtctrical Widerstand (TEER) durch die Monoschicht über 24 h nachzuweisen Überleben des Caco-2-Zell-Monolayer und physikalische Trennung der apikalen und basolateralen Kompartimenten unter niedrigen Sauerstoffgehalt in der apikalen Kammer. Der TEER von Monoschichten in VDCs in der Variablen Atmosphäre Inkubator (mikroaeroben Bedingungen) und in einem Standard-Zellkultur CO 2-Inkubator (aeroben Bedingungen) beibehalten zeigten keine signifikanten Unterschiede, was darauf hinweist Integrität der Zellschicht unter verschiedenen atmosphärischen Bedingungen 1. Unter mikroaeroben Bedingungen blieb Tight Junctions Gegenwart und gleichmäßig zwischen den Zell-Grenzen mit einer Occludin Färbungsmusters ähnlich Zellen unter aeroben Bedingungen gehalten 1 verteilt.
Die Wechselwirkungen von C. jejuni Caco-2 und T84-Zellen in der VDC wurden durch die Bewertung bakteriellen Wechselwirkung (Adhäsion und Invasion) und Invasion untersucht. Zwei verschiedene C. jejuni Wildtyp Strains wurden 1 verwendet. C. jejuni 11168H eine hypermotile Derivat der ursprünglichen Sequenz Stamm NCTC11168. Die 11168H Stamm zeigt viel höhere Besiedlung Ebenen in einem Küken Kolonisation Modell und ist somit eine geeignete Sorte für Wirt-Pathogen-Interaktion Studien verwenden berücksichtigt. 81 bis 176 ist eine menschliche isolieren und ist eine der häufigsten untersuchten invasive Laborstämme. C. jejuni Stämme wurden zur apikalen Abteil eines VDC entweder unter mikroaeroben oder aeroben Bedingungen aufgenommen. Wir beobachteten höheren Raten sowohl für Interaktion und Invasion von C. wurden aufgezeichnet jejuni unter mikroaeroben Bedingungen 1. Die erhöhte C. jejuni-Wechselwirkungen nicht aufgrund einer Zunahme der Bakterienzahl unter mikroaeroben Bedingungen 1. Diese Daten stützen die Hypothese, dass die sauerstoffarme Umgebung in der apikalen Kammer des VDC Bakterien-Wirt-Wechselwirkungen erhöht und zeigt an, dass die invasive Eigenschaften C. jejuni sind incrgelockert unter diesen Bedingungen. Dies war der erste Bericht über die Verwendung der VDC-Modell, um eine invasive bakterielle Krankheitserreger studieren und unterstreicht die Bedeutung der Durchführung in vitro-Assays Infektion unter den Bedingungen, dass mehr genau imitieren die in vivo Situation. Das VDC Modell könnte verwendet werden, um die Wirt-Pathogen-Interaktionen für viele verschiedene Bakterienarten zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Verwendung von in vitro-Zellkultur Methoden, um die Wechselwirkungen von bakteriellen Erregern mit Wirtszellen zu studieren, ist eine Technik, die weit verbreitet in vielen Forschungslabors eingesetzt. Jedoch als solche Zellkultur-Assays unter aeroben Bedingungen durchgeführt wird, diese in-vitro-Modellen nicht genau den in-vivo-Umgebung, wobei der Wirt-Pathogen-Interaktionen stattfinden. Die weit verbreitete Infektion in vitro Modelle sind besonders ungeeignet für das Studium m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dominic Mills wurde von einem Bloomsbury Colleges Doktoratsstipendium (2007-2010) unterstützt. Die Autoren möchten sowohl Ozan Gundogdu und Abdi Elmi für ihre Unterstützung bei der Entwicklung des VDC Modell danken.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts | Harvard Apparatus | 66-0001 | Manifold & six Snapwell chambers |
| Caps | Harvard Apparatus | 66-0020 | |
| O-rings | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
| Clamps | Harvard Apparatus | 66-0012 | |
| Snapwell filters (pore size 0.4 μm) | Corning Costar | 3407 | |
| Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter | Millipore | MERS00002 | |
| WPA Lightwave II spectrophotometer | Biochrom | 80-3003-72 |
References
- Mills, D. C., et al. Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment. Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).
- Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465, 355-358 (2010).
- Dorrell, N., Wren, B. W. The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems. Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).
- Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis. Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).
- Hu, L., Kopecko, D. J., Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. Chapter 17. Campylobacter. , 297-313 (2008).
- Everest, P. H., et al. Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli. J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).
- Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures. Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).
- Monteville, M. R., Konkel, M. E. Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface. Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).
- Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms. J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).
- Schuller, S., Phillips, A. D. Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells. Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).
- Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling. J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).
