आंतों उपकला कोशिकाओं की आंतों बैक्टीरियल आक्रमण<em> इन विट्रो में</em> नाटकीय रूप से एक कार्यक्षेत्र प्रसार चैंबर मॉडल का उपयोग बढ़ाया है
Summary
एरोबिक परिस्थितियों में बैक्टीरियल आसंजन और आक्रमण की जांच के लिए सेल संस्कृति assays के प्रदर्शन का आमतौर पर unrepresentative है<em> Vivo में</em> पर्यावरण. एक कार्यक्षेत्र प्रसार चैंबर मॉडल मानव रोगज़नक़ की बातचीत के अध्ययन की अनुमति देता है<em> Campylobacter jejuni</em> और अधिक तहत आंतों उपकला कोशिकाओं के साथ<em> Vivo में</emशर्तों> की तरह, बढ़ाया जीवाणु आक्रमण में जिसके परिणामस्वरूप.
Abstract
मेजबान कोशिकाओं के साथ बैक्टीरियल रोगज़नक़ों की बातचीत विट्रो सेल संस्कृति तरीकों में उपयोग करते हुए बड़े पैमाने पर जांच की गई है. इस तरह के सेल संस्कृति assays के एरोबिक शर्तों के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं लेकिन, जैसा कि इन विट्रो मॉडल में सही मेजबान रोगज़नक़ बातचीत जगह ले जिसमें vivo वातावरण में प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता. हम विभिन्न मध्यम और गैस परिस्थितियों में बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं के coculture परमिट कि संक्रमण का एक में इन विट्रो मॉडल विकसित किया है. कार्यक्षेत्र प्रसार चैंबर (समिति) मॉडल बैक्टीरिया बहुत कम ऑक्सीजन whilst के ऊतकों की शर्तों के तहत किया जाएगा, जहां मानव आंत में स्थितियों को रक्त प्रवाह से ऑक्सीजन की आपूर्ति की जाएगी mimics. एक समिति में Snapwell आवेषण में उगाई ध्रुवीकृत आंतों उपकला सेल (आईईसी) monolayers रखकर अलग शिखर और basolateral डिब्बों बनाता है. basolateral डिब्बे, सेल संस्कृति माध्यम से भरा सील और ऑक्सीजन w के साथ perfused हैशिखर डिब्बे hilst शोरबा से भर जाता है, खुला रखा और microaerobic परिस्थितियों में incubated. Caco -2 और T84 दोनों IECs सेल अस्तित्व या monolayer की अखंडता पर कोई स्पष्ट हानिकारक प्रभाव के बिना इन शर्तों के तहत ग्राम रक्षा समिति में बनाए रखा जा सकता है. Coculturing प्रयोगों अलग सी. के साथ प्रदर्शन शिखर डिब्बे में microaerobic शर्तों के साथ जेजुनी जंगली प्रकार उपभेदों और ग्राम रक्षा समिति के मॉडल में अलग आईईसी लाइनों reproducibly एरोबिक संस्कृति की स्थिति की तुलना में एक बातचीत के दौरान की संख्या (लगभग 10 गुना) में वृद्धि और intracellular (लगभग 100 गुना) बैक्टीरिया में परिणाम 1. ग्राम रक्षा समिति के मॉडल में बनाया माहौल और अधिक बारीकी सी. द्वारा सामना वातावरण mimics और मानव आंत में जेजुनी अधिक बारीकी विवो वास्तविकता में है कि नकल की शर्तों के तहत इन विट्रो संक्रमण assays में प्रदर्शन के महत्व पर प्रकाश डाला गया. हम समिति मॉडल का उपयोग करें कि बातचीत की नई व्याख्याओं शर्त अनुमति देगा का प्रस्तावबैक्टीरियल रोगज़नक़ों और मेजबान कोशिकाओं को समझना.
Introduction
मेजबान कोशिकाओं के साथ बैक्टीरियल रोगज़नक़ों की बातचीत विट्रो सेल संस्कृति तरीकों में उपयोग करते हुए बड़े पैमाने पर जांच की गई है. इस तरह के सेल संस्कृति assays के मेजबान कोशिकाओं को बैक्टीरियल आसंजन, मेजबान सेल रिसेप्टर्स, रास्ते और मेजबान कोशिकाओं के जीवाणु आक्रमण संकेत मेजबान सेल की पहचान का उपयोग करना सभी कई महत्वपूर्ण टिप्पणियों में जिसके परिणामस्वरूप विस्तार से अध्ययन किया गया है. हालांकि इस तरह के सेल संस्कृति assays के vivo वातावरण में की प्रतिनिधि नहीं हो सकता कि एरोबिक शर्तों के तहत किया जाता है. गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल संक्रमण का अध्ययन किया विट्रो मॉडल में से एक प्रमुख सीमा उच्च ऑक्सीजन का स्तर सहित संस्कृति की स्थिति आम तौर पर यूकेरियोटिक सेल अस्तित्व के पक्ष में है. हालांकि आंतों लुमेन में स्थिति लगभग अवायवीय हो जाएगा. एक बहुत कम ऑक्सीजन वातावरण में आंत्र रोगजनकों जिनकी अभिव्यक्ति परिवर्तन एरोबिक शर्तों के तहत 2 डाह जीन व्यक्त करते हैं. जैसे, डेटा मानक सेल संस्कृति मॉडल मीटर का उपयोग कर प्राप्तप्र मेजबान कोशिकाओं के साथ बैक्टीरियल बातचीत के एक गलत संकेत देते हैं.
Campylobacter jejuni हल्के दस्त से गंभीर भड़काऊ आंत्रशोथ को लेकर है कि लक्षणों के साथ, दुनिया भर में बैक्टीरियल तीव्र आंत्रशोथ का प्रमुख प्रेरणा का एजेंट है. सी. के बहुमत सीधी आंत्रशोथ में जेजुनी संक्रमण के परिणाम, तथापि सी. जेजुनी भी Guillain-Barre सिंड्रोम (जीबीएस) सहित परिधीय neuropathies में सबसे अधिक पहचान संक्रामक एजेंट है. ब्रिटेन में, यह सी. के कारण आंत्रशोथ के 500,000 से अधिक मामलों रहे हैं अनुमान है कि £ 580000000 की ब्रिटेन की अर्थव्यवस्था के लिए एक अनुमानित लागत के साथ जेजुनी संक्रमण हर साल. विकासशील दुनिया में, सी. जेजुनी बच्चों में मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण है. ज़ाहिर कैम्पिलोबैक्टर संक्रमण का महत्व और पूरी तरह से जीनोमिक्स आधारित विश्लेषण, सी सहित अनुसंधान के दशकों के बावजूद जेजुनी रोगजनन अभी भी खराब समझ हैood, ऐसे साल्मोनेला, ई. कोलाई, शिगेला, और विब्रियो कोलरा के रूप में अन्य आंतों रोगजनकों के विपरीत. एक सुविधाजनक छोटे पशु मॉडल की कमी इस 3 के लिए एक प्रमुख कारण है. इसके अलावा व्यापक रूप से इन विट्रो संक्रमण मॉडल में इस्तेमाल microaerophilic सी. के अध्ययन के लिए और अधिक अनुचित हैं ऐच्छिक anaerobes हैं कि अन्य आंतों रोगजनकों के लिए की तुलना जेजुनी. Whilst सी. जेजुनी एक आक्रामक रोगज़नक़, सी. के तंत्र के रूप में मान्यता प्राप्त है आंतों उपकला कोशिकाओं के जेजुनी आक्रमण (IECs) अभी 4,5 स्पष्ट नहीं कर रहे हैं. सी. जेजुनी आक्रमण या तो microfilaments, सूक्ष्मनलिकाएं, दोनों का एक संयोजन या न 5 पर निर्भर होना दिखाया गया है. इस क्षेत्र में भ्रम की स्थिति सबसे शायद इन विट्रो परख स्थितियों में अनुपयुक्त के उपयोग की वजह से है.
अलग सेल संस्कृति assays के एक नंबर सी की बातचीत की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है जेजुनीमेजबान कोशिकाओं के साथ. Caco-2 6, INT 407 7, और T84 8 सेल लाइनों के सभी विभिन्न सी. के आसंजन और आक्रमण क्षमताओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है jejuni उपभेदों. हालांकि, सी के लिए बैक्टीरियल आसंजन और आक्रमण के स्तर IECs साथ जेजुनी अन्य आंतों रोगजनकों 9 से नाटकीय रूप से कम कर रहे हैं. सी. के coculturing IECs साथ जेजुनी सामान्य रूप से IECs के अस्तित्व के लिए आवश्यक है, वायुमंडलीय ऑक्सीजन के स्तर के करीब परिस्थितियों में एक सीओ 2 इनक्यूबेटर में किया जाता है. सी. जेजुनी जीन अभिव्यक्ति वायुमंडलीय ऑक्सीजन की स्थिति की तुलना में आंतों लुमेन के कम ऑक्सीजन वातावरण में बहुत अलग हो जाएगा.
एक कार्यक्षेत्र प्रसार चैंबर (समिति) प्रणाली का उपयोग विभिन्न मध्यम और गैस शर्तों 1,10,11 तहत बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं के coculture परमिट जो विकसित किया गया है. इस प्रणाली बैक्टीरिया संयुक्त राष्ट्र होगा जहां मानव आंत में शर्तों mimicsबहुत कम ऑक्सीजन whilst के ऊतक के डेर शर्तों रक्त प्रवाह से ऑक्सीजन की आपूर्ति की जाएगी. विशेष 0.4 माइक्रोन फिल्टर में उगाई फूट डालना आईईसी monolayers के अलग – अलग बैक्टीरिया शोरबा और क्रमशः सेल संस्कृति माध्यम (चित्रा 1) के साथ भर दिया गया है, जो एक शिखर और basolateral डिब्बे बनाने, एक ग्राम रक्षा समिति में रखा गया था. ग्राम रक्षा समिति चर माहौल इनक्यूबेटर 37 में 85% एन 2, 5% 2 हे, और 10% सीओ 2 युक्त डिग्री सेल्सियस, सी. के लिए इष्टतम स्थितियों का प्रतिनिधित्व में रखा गया था जेजुनी. शिखर डिब्बे खुला छोड़ दिया और चर माहौल इनक्यूबेटर भीतर microaerobic वातावरण के संपर्क में था, मोहरबंद basolateral डिब्बे whilst 5% सीओ 2 / दबाव के संचय को रोकने के लिए एक दुकान ट्यूब के साथ 95% 2 हे गैस मिश्रण के लगातार प्रशासन द्वारा ऑक्सीजन की आपूर्ति के साथ किया गया था . इन परिस्थितियों में Caco -2 सेल अस्तित्व और monolayer की अखंडता transepithelial तत्वों की निगरानी के द्वारा पुष्टि की गई24 घंटा से अधिक monolayer भर ctrical प्रतिरोध (तीर) शिखर डिब्बे में कम ऑक्सीजन परिस्थितियों में शिखर और basolateral डिब्बों की Caco -2 सेल monolayer और शारीरिक जुदाई के अस्तित्व को प्रदर्शित करने के लिए. चर माहौल इनक्यूबेटर (microaerobic शर्तों) में और एक मानक सेल संस्कृति सीओ 2 इनक्यूबेटर (एरोबिक शर्तों) में बनाए रखा ग्राम रक्षा समितियों में monolayers के तीर विभिन्न वायुमंडलीय स्थितियों 1 के तहत सेल monolayer की अखंडता को दर्शाता है, कोई महत्वपूर्ण अंतर दिखाया. Microaerobic शर्तों के तहत, तंग जंक्शनों वर्तमान और समान रूप से एरोबिक स्थितियों 1 के तहत बनाए रखा कोशिकाओं के समान occludin धुंधला पैटर्न के साथ सेल की सीमाओं के बीच वितरित बने रहे.
सी. की बातचीत ग्राम रक्षा समिति में Caco -2 और T84 कोशिकाओं के साथ जेजुनी बैक्टीरियल बातचीत (आसंजन और आक्रमण) और आक्रमण का आकलन करने से जांच की गई. दो अलग सी. जेजुनी जंगली प्रकार straiएनएस 1 इस्तेमाल किया गया. सी. जेजुनी 11168H मूल अनुक्रम तनाव NCTC11168 की एक hypermotile व्युत्पन्न है. 11168H तनाव एक लड़की बसाना मॉडल में बहुत अधिक उपनिवेशवाद के स्तर से पता चलता है और इस प्रकार मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के अध्ययन के लिए उपयोग करने के लिए एक उपयुक्त तनाव माना जाता है. 81-176 एक मानव को अलग है और सबसे आक्रामक व्यापक रूप से अध्ययन प्रयोगशाला उपभेदों में से एक है. सी. jejuni उपभेदों microaerobic या एरोबिक शर्तों या तो अधीन एक समिति के शिखर डिब्बे में जोड़ा गया था. हम बातचीत और आक्रमण दोनों के लिए उच्च दर सी. के लिए दर्ज किया गया मनाया microaerobic शर्तों के तहत 1 जेजुनी. बढ़ी हुई सी. जेजुनी बातचीत microaerobic शर्तों के तहत 1 जीवाणु की संख्या में वृद्धि के कारण नहीं थे. इस डेटा में ग्राम रक्षा समिति के शिखर डिब्बे में कम ऑक्सीजन वातावरण बैक्टीरिया मेजबान बातचीत को बढ़ाता है और यह संकेत करता है कि हमारी परिकल्पना का समर्थन करता है कि सी. के आक्रामक गुण जेजुनी incr हैंइन परिस्थितियों में ढील. यह एक आक्रामक जीवाणु रोगज़नक़ अध्ययन करने के लिए ग्राम रक्षा समिति के मॉडल के उपयोग की पहली रिपोर्ट था और अधिक बारीकी से vivo स्थिति में है कि नकल की शर्तों के तहत इन विट्रो संक्रमण assays में प्रदर्शन के महत्व पर प्रकाश डाला गया. ग्राम रक्षा समिति के मॉडल के कई अलग अलग प्रजातियों के जीवाणु के लिए मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
मेजबान कोशिकाओं के साथ बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के संबंधों का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो सेल संस्कृति विधियों के उपयोग व्यापक रूप से कई अनुसंधान प्रयोगशालाओं में कार्यरत एक तकनीक है. इस तरह के ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
डोमिनिक मिल्स एक ब्लूम्सबरी कालेजों पीएचडी छात्रवृत्ति (2007-2010) द्वारा समर्थित किया गया था. लेखकों ग्राम रक्षा समिति के मॉडल को विकसित करने में उनकी सहायता के लिए Ozan Gundogdu और अब्दी Elmi दोनों को धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts | Harvard Apparatus | 66-0001 | Manifold & six Snapwell chambers |
| Caps | Harvard Apparatus | 66-0020 | |
| O-rings | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
| Clamps | Harvard Apparatus | 66-0012 | |
| Snapwell filters (pore size 0.4 μm) | Corning Costar | 3407 | |
| Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter | Millipore | MERS00002 | |
| WPA Lightwave II spectrophotometer | Biochrom | 80-3003-72 |
References
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