腸管上皮細胞の腸内細菌の侵入<em>インビトロ</em>劇的垂直拡散室モデルを用いた強化され
Summary
好気的条件下で細菌の付着および浸潤を調べるための細胞培養アッセイを行うと、通常の典型的である<em生体内で></em>環境。垂直拡散室モデルは、ヒト病原体の相互作用の研究を可能にします<em>カンピロバクター</emもっと下の腸上皮細胞と><em生体内で></em条件>のような、強化された細菌の侵入になる。
Abstract
宿主細胞と細菌性病原体の相互作用は、in vitro細胞培養法での使用広範囲に研究されてきた。例えば、細胞培養アッセイは好気的条件下で行われるしかし、これらは、in vitroモデルにおいて正確にホスト病原体の相互作用が行われたインビボ環境では表していない可能性がある。我々は、異なる媒体とガス条件下で細菌および宿主細胞の共培養を可能にする感染のインビトロのモデルを開発した。垂直拡散室（VDC）のモデルは、細菌が非常に低酸素ながら組織の条件の下になり、人間の腸内での条件が血流からの酸素が供給される模倣。 VDCにSnapwellを挿入で栽培偏腸管上皮細胞（IEC）単層を配置すると、別個の頂端と基底外側の区画を作成します。基底外側区画は、細胞培養培地で充填密封し、酸素ワットで灌流されている微好気条件下でのオープンとインキュベート保ち、頂端区画はスープで満たされているhilst。両方のCaco-2およびT84 IECSは、細胞生存または単層の整合性に明らかな悪影響することなく、これらの条件下で、VDCに維持することができる。異なるCで行わ共培養実験頂端側画分における微好気条件でジェジュニ野生株とVDCモデルにおける異なるIEC線は再現性好気培養条件と比較して、相互作用の数（約10倍）の増加および細胞内（略100倍）細菌をもたらす1。 VDCモデルで作成した環境は、より密接にCで遭遇する環境を模倣人間の腸内ジェジュニとより密接に生体現実に模倣するという条件の下でのin vitro感染アッセイを行うことの重要性を強調しています。私たちは、VDCモデルの使用は、相互作用の新たな解釈は賭けることができますことを提案細菌性病原体と宿主細胞を予期する。
Introduction
宿主細胞と細菌性病原体の相互作用は、in vitro細胞培養法での使用広範囲に研究されてきた。例えば、細胞培養アッセイを用いて、宿主細胞、宿主細胞受容体の同定、宿主細胞シグナル伝達経路および宿主細胞の細菌侵入に対する細菌の付着は、すべての多くの重要な観察結果として、詳細に研究されている。しかしながら、細胞培養アッセイは、インビボ環境を代表しないかもしれない好気的条件下で行われる。胃腸感染を研究するために使用されるin vitroモデルの主な制限は、高い酸素レベルを含む培養条件は、一般に、真核細胞の生存を支持することである。しかし腸管腔の状況はほぼ嫌気性になります。非常に低酸素環境での腸内病原体はその発現が変化する好気的条件下で2病原性遺伝子を発現する。このように、データは、標準的な細胞培養モデルを用いて得メートルAYは、宿主細胞と細菌相互作用の不正確な表示を与える。
カンピロバクターは、軽度の下痢から重度の炎症性腸炎に及ぶという症状を、世界的な細菌性急性胃腸炎の主要な原因物質である。 C.の大半合併症のない胃腸炎でジェジュニ感染の結果、しかし、C.ジェジュニは、ギラ ン·バレー症候群（GBS）を含む末梢神経障害でも最も一般的に同定され感染性病原体である。英国では、C.によって引き起こされる腸炎の50万人以上のケースがあると推定されているポンド5.8億の英国経済への予測コストジェジュニ感染毎年。発展途上国では、C.ジェジュニは、子どもの死亡の主要な原因である。紛れもカンピロバクター感染症の重要性と徹底したゲノムベースの分析、C.含む研究の数十年にもかかわらず、 ジェジュニ病因は依然として不十分understですOOD、そのようなサルモネラ 、 大腸菌 、 赤痢菌 、およびコレラ菌などの他の腸の病原体とは対照的である。便利な小さな動物モデルの欠如は、この3つの主な理由です。も広くビトロ感染モデルで使用気性Cを研究するためのより多くの不適切な通性嫌気性菌であり、他の腸内病原体のためのよりジェジュニ 。ながらC.ジェジュニは侵襲的な病原体、Cのメカニズムとして認識されている腸上皮細胞のジェジュニ侵攻（IECS）は依然として不明である4,5。C.ジェジュニ侵入はマイクロフィラメント、微小管、両方またはどちらも5の組み合わせのどちらかに依存することが示されている。このエリアの混乱はおそらくビトロアッセイ条件の通報を使用することによるものである。
異なる細胞培養アッセイの数は、C.の相互作用を調査するために使用されているジェジュニ宿主細胞である。のCaco-2 6、INT 407 7、およびT84 8細胞株は、すべての異なる℃の接着および浸潤能力を研究するために使用されているジェジュニ菌株。しかし、Cの細菌の付着と侵入のレベルIECSとジェジュニは他の腸病原体9に比べ劇的に低くなっています。 Cの共培養IECSとジェジュニは、通常IECSの生存に必要な、大気中の酸素濃度に近い条件下で、CO 2インキュベーター内で行われる。℃でジェジュニ遺伝子の発現は、大気中の酸素条件と比較して腸管腔の低酸素環境において非常に異なるであろう。
垂直方向の拡散室（VDC）システムの使用は、異なる媒体とガス条件1,10,11で細菌および宿主細胞の共培養を可能に開発されている。このシステムは、細菌が解除になり、人間の腸内の条件を模倣非常に低い酸素ながら組織のファンデ条件は、血流からの酸素が供給される。特別0.4μmのフィルターで増殖偏IEC単層をそれぞれ個別細菌ブロスおよび細胞培養培地が充填され（ 図1）とした頂端側底区画を作成VDCに入れた。 VDCは、変数雰囲気のインキュベーターは、37℃で85％のN 2、5％O 2、10％CO 2を含有する°C、Cの最適条件を表すに入れたジェジュニ 。頂端側画分が開いたままと可変雰囲気のインキュベーター内で微好気雰囲気にさらされた、密封された側底区画をしながら、5％CO 2 /圧力の蓄積を防止する出口管と、95％O 2ガス混合物の一定の投与により酸素を供給した。これらの条件下でのCaco-2細胞の生存および単層の完全性が経上皮エレメントを監視することによって確認されたのCaco-2細胞単層と頂端コンパートメント内低酸素条件下での頂端と基底外側区画の物理的な分離の生存を実証するため、24時間以上の単層にわたるctrical抵抗（TEER）。変数雰囲気インキュベーター（微好気条件）で、標準的な細胞培養CO 2インキュベーター（好気的条件）で維持のVDCで単層のTEERは異なる大気条件1の下で細胞単層の完全性を示す有意な差は認められなかった。微好気条件下では、タイトジャンクションが存在し、均等に好気性条件1の下で維持された細胞に類似オクルディン染色パターンでセルの枠線との間で分配さ残った。
Cの相互作用VDC内のCaco-2とT84細胞とジェジュニは、細菌の相互作用（接着と浸潤）と浸潤を評価することによって調べた。二つの異なるC.ジェジュニ野生型straiNSは、1を使用しました。Cでジェジュニ 11168Hは、元のシーケンス株NCTC11168のhypermotile誘導体である。 11168H株はひよこ植民モデルではるかに高い植民地化レベルを示し、したがって、宿主 – 病原体相互作用の研究のために使用するのに適した菌株と考えられている。 81から176を分離人間であり、ほとんどの侵襲広く研究されている実験室株の一つである。C.ジェジュニ株は微好気性の条件のどちらかまたは下VDCの頂端の区画に追加されました。我々は相互作用と侵略の両方に高いレートはCのために記録された観察微好気条件1の下ジェジュニ 。増加したC.ジェジュニ相互作用は微好気条件1の下での細菌数の増加によるものではなかった。このデータは、VDCの先端コンパートメントにおける低酸素環境が細菌-宿主相互作用を強化し、示していると我々の仮説をサポートするCの侵襲的な性質ジェジュニは INCRですこれらの条件下で緩和。これは、侵襲的な細菌性病原体を研究するVDCモデルの使用の最初の報告書だったとより密接に生体状況で模倣するという条件の下でのin vitro感染アッセイで行うの意義を強調しています。 VDCモデルは、多くの異なる細菌種のホスト病原体の相互作用を研究するために使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
宿主細胞と細菌性病原体の相互作用を研究するためのin vitro細胞培養法での使用が広く多くの研究室で用いられる技術である。例えば、細胞培養アッセイは好気的条件下で行われるしかし、これらは、in vitroモデルにおいて正確にホスト病原体の相互作用が行われたインビボ環境では表していない可能性がある。広く試験管内感染モデルで使用さ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ドミニクミルズはブルームズベリー大学博士学生の身分（2007-2010年）のによってサポートされていました。著者は、VDCのモデルを開発する上で彼らの支援のためにルブラGundogduとアブディエルミ両方に感謝したいと思います。
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts | Harvard Apparatus | 66-0001 | Manifold & six Snapwell chambers |
| Caps | Harvard Apparatus | 66-0020 | |
| O-rings | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
| Clamps | Harvard Apparatus | 66-0012 | |
| Snapwell filters (pore size 0.4 μm) | Corning Costar | 3407 | |
| Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter | Millipore | MERS00002 | |
| WPA Lightwave II spectrophotometer | Biochrom | 80-3003-72 |
References
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