Entérica invasión bacteriana de las células epiteliales intestinales<em> In Vitro</em> Se ha mejorado considerablemente gracias a un modelo de cámara de difusión vertical

Summary

Realización de ensayos de cultivo celular para investigar la adhesión bacteriana y la invasión en condiciones aerobias es generalmente representativo de la<em> In vivo</em> Medio ambiente. Un modelo de cámara de difusión vertical permite el estudio de las interacciones del patógeno humano<em> Campylobacter jejuni</em> Con las células epiteliales del intestino más bajo<em> In vivo</em> Condiciones similares, lo que resulta en una mayor invasión bacteriana.

Abstract

Las interacciones de patógenos bacterianos con células huésped se han investigado extensamente en el uso de métodos de cultivo celular in vitro. Sin embargo, como estos ensayos de cultivo celular se realizan bajo condiciones aeróbicas, estos modelos in vitro pueden no representar con precisión el entorno in vivo en el que las interacciones huésped-patógeno se llevan a cabo. Hemos desarrollado un modelo in vitro de la infección en que permite que el co-cultivo de las bacterias y las células huésped bajo diferentes condiciones de medio y de gas. La cámara de difusión vertical (VCC) modelo imita las condiciones en el intestino humano, donde las bacterias estarán en condiciones de muy baja, mientras que los tejidos de oxígeno serán suministrados con el oxígeno del torrente sanguíneo. La colocación de monocapas de células epiteliales intestinales polarizadas (IEC) obtenidas en los prospectos Snapwell en una VDC crea compartimentos apical y basolateral separados. El compartimento basolateral se llena con medio de cultivo celular, sellado y perfundidos con oxígeno wHilst el compartimiento apical está lleno de caldo, mantienen abiertas y se incubaron bajo condiciones microaeróbicas. Tanto Caco-2 y T84 IECs se pueden mantener en el VDC bajo estas condiciones, sin efectos perjudiciales aparentes sobre la supervivencia celular o integridad de la monocapa. Experimentos de cocultivo a cabo con diferentes C. jejuni cepas de tipo salvaje y diferentes líneas de IEC en el modelo VCC con condiciones microaeróbicas en el compartimiento apical reproducible resultan en un aumento en el número de interactuar (casi 10 veces) y las bacterias intracelulares (casi 100 veces) en comparación a las condiciones de cultivo aerobio ^1. El ambiente creado en el modelo VDC imita más de cerca el ambiente encontrado por C. jejuni en el intestino humano y pone de relieve la importancia de llevar a cabo en ensayos de infección in vitro en condiciones que imitan más estrechamente la realidad in vivo en el. Proponemos que el uso del modelo VDC permitirá nuevas interpretaciones de las interacciones apuestaween patógenos bacterianos y células huésped.

Introduction

Las interacciones de patógenos bacterianos con células huésped se han investigado extensamente en el uso de métodos de cultivo celular in vitro. El uso de estos ensayos de cultivo celular, la adhesión bacteriana a las células huésped, la identificación de los receptores de la célula huésped, célula huésped vías de señalización y la invasión bacteriana de células huésped todas han sido estudiados en detalle, lo que resulta en muchas observaciones importantes. Sin embargo, tales ensayos de cultivo celular se realizan bajo condiciones aeróbicas que pueden no ser representativos de la ambiente in vivo. Una limitación importante de los modelos in vitro utilizados para estudiar infecciones gastrointestinales es que las condiciones de cultivo, incluyendo altos niveles de oxígeno generalmente favorecen la supervivencia celular eucariota. Sin embargo las condiciones en el lumen intestinal serán casi anaeróbica. Patógenos entéricos en un entorno muy poco oxígeno expresan genes de virulencia cuya expresión cambia en condiciones aeróbicas ^2. Como tal, los datos obtenidos utilizando el estándar de cultivo celular modelos may dar una indicación inexacta de las interacciones con las células huésped bacterianas.

Campylobacter jejuni es el agente causal principal de gastroenteritis aguda bacteriana en todo el mundo, con síntomas que van desde diarrea leve hasta enteritis inflamatoria severa. La mayoría de C. jejuni infecciones producen gastroenteritis sin complicaciones, sin embargo C. jejuni es también el agente infeccioso identificado con mayor frecuencia en las neuropatías periféricas, incluyendo el síndrome de Guillain-Barré (GBS). En el Reino Unido, se estima que hay más de 500.000 casos de enteritis causadas por C. jejuni infección cada año con un coste previsto de la economía del Reino Unido de £ 580 millones. En el mundo en desarrollo, C. jejuni es la causa principal de mortalidad entre los niños. A pesar de la indudable importancia de la infección por Campylobacter y décadas de investigación, incluido el análisis basada en la genómica completa, C. jejuni patogenia es aún mal comprendood, en contraste con otros patógenos entéricos, tales como Salmonella, Escherichia coli, Shigella y Vibrio cholerae. La falta de un modelo animal pequeño conveniente es una razón principal para este ^3. También el ampliamente utilizado en modelos de infección in vitro son más apropiado para el estudio de microaerophilic C. jejuni que para otros patógenos entéricos que son anaerobios facultativos. Mientras que C. jejuni es reconocido como un patógeno invasor, los mecanismos de C. jejuni invasión de las células epiteliales intestinales (IECS) aún no están claros ^4,5. C. invasión jejuni ha demostrado ser dependiente de cualquiera de microfilamentos, microtúbulos, una combinación de ambos o ninguno ^5. La confusión en esta zona es muy probablemente debido a la utilización de no apropiado en condiciones de ensayo in vitro.

Un número de diferentes ensayos de cultivo celular se han utilizado para investigar las interacciones de C. jejunicon las células huésped. Caco-2 ^6, INT 407 ^7, y ⁸ líneas de células T84 han todos han utilizado para estudiar las capacidades de adherencia y la invasión de diferentes C. jejuni cepas. Sin embargo, los niveles de la adhesión bacteriana y la invasión de C. jejuni con IECs son considerablemente inferiores a los de otros patógenos entéricos ^9. El cocultivo de C. jejuni con IECs se realiza normalmente en un incubador _{de CO2} en condiciones próximas a los niveles de oxígeno atmosférico, necesario para la supervivencia de IECs. C. la expresión de genes jejuni será muy diferente en el entorno de bajo oxígeno de la luz intestinal en comparación con las condiciones de oxígeno atmosférico.

El uso de un sistema de cámara de difusión vertical (VCC) ha sido desarrollado que permite el co-cultivo de las bacterias y las células huésped bajo diferentes condiciones de medio y de gas ^1,10,11. Este sistema imita las condiciones en el intestino humano, donde las bacterias no sufriráder condiciones de muy bajo, mientras que los tejidos de oxígeno se suministran con el oxígeno de la corriente de la sangre. Monocapas de IEC polarizadas cultivadas en filtros de 0,4 micras especiales se colocaron en una VCC la creación de un compartimento apical y basolateral, que se llenaron individualmente con caldo bacteriano y medio de cultivo celular, respectivamente (Figura 1). El VDC se colocó en la atmósfera variable de incubadora que contiene 85% de N _2, 5% de O _2, y CO ₂ al 10% a 37 ° C, que representa las condiciones óptimas para C. jejuni. El compartimento apical se dejó abierta y expuesta a la atmósfera microaerobia dentro de la atmósfera variable de incubadora, mientras que el compartimento basolateral sellada fue suministrado con oxígeno mediante la administración constante de 5% de CO _2/95% de O ₂ mezcla de gas con un tubo de salida prevención de la acumulación de la presión . Caco-2 y la supervivencia celular integridad de la monocapa en estas condiciones se confirmaron mediante la supervisión del elemento transepitelialresistencia ctrical (TEER) a través de la monocapa de más de 24 horas para demostrar la supervivencia de células Caco-2 monocapa celular y separación física de los compartimentos apical y basolateral en condiciones bajas de oxígeno en el compartimiento apical. La TEER de monocapas en los CDA mantenidos en la atmósfera incubadora variables (condiciones microaeróbicas) y en un cultivo de células de CO ₂ incubadora estándar (condiciones aeróbicas) no mostró diferencias significativas, indicando la integridad de la monocapa de células en diferentes condiciones atmosféricas ^1. En condiciones microaeróbicas, uniones estrechas se mantuvo presente y distribuida de manera uniforme entre los bordes de las celdas con un patrón de tinción similar a la ocludina células mantenidas en condiciones aeróbicas ^1.

Las interacciones de C. jejuni con células Caco-2 y células T84 en el VDC fueron investigados mediante la evaluación de la interacción bacteriana (adherencia y la invasión) y la invasión. Dos diferentes C. jejuni wild-type strains se utilizaron ^1. C. jejuni 11168H es un derivado de la cepa hypermotile secuencia original NCTC11168. La cepa 11168H muestra los niveles de colonización mucho más altos en un modelo de colonización de pollo y por lo tanto se considera una cepa adecuada a utilizar para estudios de interacción huésped-patógeno. 81-176 es un aislado de humanos y es una de las cepas de laboratorio ampliamente estudiados más invasivos. C. jejuni cepas fueron añadidos al compartimiento apical de una VCC ya sea bajo condiciones microaeróbicas o aeróbico. Hemos observado tasas más altas tanto para la interacción y la invasión se registraron para C. jejuni en condiciones microaeróbicas ^1. El aumento de la C. interacciones jejuni no se debieron a un aumento en el número de bacterias en condiciones microaerobias ^1. Estos datos apoyan nuestra hipótesis de que el entorno de bajo nivel de oxígeno en el compartimento apical de la VCC mejora las interacciones bacteria-huésped e indica que las propiedades invasivas de C. jejuni son incraliviado en estas condiciones. Este fue el primer informe del uso del modelo de VCC para estudiar un patógeno bacteriana invasiva y pone de relieve la importancia de llevar a cabo en ensayos de infección in vitro en condiciones que más estrechamente imita la situación in vivo. El modelo VCC podría ser utilizado para estudiar las interacciones huésped-patógeno para muchas especies bacterianas diferentes.

Protocol

1. El crecimiento de monocapas IEC en especial 0.4 Filtros micras Cultura Caco-2 células en medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% (v / v) de suero de ternero fetal, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 1% (v / v) de aminoácidos no esenciales en una tejido estándar de cultivo en estufa a 37 ° C en 5% de CO2 y 95% de aire. Seed 4 x 10 5 células Caco-2 IECs por 0,4 micras filtran y crecen a la polarización durante 21 días, el cambio de…

Representative Results

Experimentos de cocultivo realizaron con un C. jejuni cepa de tipo salvaje y los IEC en el modelo VCC con condiciones microaeróbicas en el compartimiento apical han demostrado un aumento en el número de interactuar (casi 10 veces) y las bacterias intracelulares (casi 100 veces) en comparación con las condiciones de cultivo aerobias en un momento que dependen de forma 1. Esta observación fue reproducible usando dos diferentes C. jejuni cepas de tipo salvaje (11168H y 81-176) y dos líneas…

Discussion

El uso de métodos de cultivo de células in vitro para estudiar las interacciones de patógenos bacterianos con células huésped es una técnica ampliamente utilizada en muchos laboratorios de investigación. Sin embargo, como estos ensayos de cultivo celular se realizan bajo condiciones aeróbicas, estos modelos in vitro pueden no representar con precisión el entorno in vivo en el que las interacciones huésped-patógeno se llevan a cabo. El ampliamente utilizado en model…

Materials

Material Name	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts	Harvard Apparatus	66-0001	Manifold & six Snapwell chambers
Caps	Harvard Apparatus	66-0020
O-rings	Harvard Apparatus	66-0007
Clamps	Harvard Apparatus	66-0012
Snapwell filters (pore size 0.4 μm)	Corning Costar	3407
Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter	Millipore	MERS00002
WPA Lightwave II spectrophotometer	Biochrom	80-3003-72