Enteriskt Bakteriell invasion av tarmepitelceller<em> In Vitro</em> Dramatiskt förbättras med hjälp av en vertikal modell diffusionskammare
Summary
Utföra cellkulturförsök för att undersöka bakteriell adhesion och invasion under aeroba förhållanden är oftast representativt för den<em> In vivo</em> Miljö. En vertikal diffusionskammare modell tillåter studie av interaktion mellan humant patogen<em> Campylobacter jejuni</em> Med tarmepitelceller enligt mer<em> In vivo</em>-Liknande förhållanden, vilket resulterar i ökad bakteriell invasion.
Abstract
Växelverkan av bakteriella patogener med värdceller har undersökts utförligt med in vitro-metoder cellkultur. Men som sådan cellkultur analyser utförs under aeroba förhållanden, dessa in vitro-modeller inte kan korrekt representera in vivo-miljö i vilken värdpatogen interaktion äger rum. Vi har utvecklat en in vitro modell av infektion som tillåter samodling av bakterier och värdceller under olika medelstora och villkor gas. Den vertikala Diffusionskammaren (VDC) modell efterliknar förhållandena i den mänskliga tarmen där bakterier kommer att vara under förhållanden med mycket låg syrehalt medan vävnad kommer förses med syrgas från blodet. Placering polariserade intestinala epitelceller (IEC) monolager odlas i Snapwell skär in i en VDC skapar separata apikala och basolaterala fack. Den basolaterala facket fylls med cellodlingsmedium, förseglades och perfusion med syre wHilst apikala facket fylls med buljong, hålls öppna och inkuberas under mikroaerob förhållanden. Både Caco-2 och T84 IECS kan upprätthållas i VDC under dessa betingelser utan några uppenbara skadliga effekter på cellöverlevnad eller monoskikt integritet. Samodling experiment med olika C. jejuni vildtyp stammar och olika IEC linjer i VDC-modeller med mikroaerob förhållanden i den apikala facket resultera reproducerbart i en ökning av det antal samverkande (nästan 10-faldig) och intracellulära (nästan 100-faldig) bakterier jämfört med aeroba odlingsbetingelser ett. Den miljö som skapas i VDC modellen närmare efterliknar miljön möter C. jejuni i den mänskliga tarmen och betonar vikten av att utföra in vitro infektion analyser under förhållanden som närmare efterlikna in vivo verkligheten. Vi föreslår att användningen av VDC-modellen kommer att möjliggöra nya tolkningar av samspelet satsalan bakteriella patogener och värdceller.
Introduction
Växelverkan av bakteriella patogener med värdceller har undersökts utförligt med in vitro-metoder cellkultur. Med användning av sådana cellodlingsanalyser, bakteriell vidhäftning till värdceller, identifiering av receptorer värdcell värdcell signalvägar och bakteriell invasion av värdceller har alla studerats i detalj, vilket resulterade i många viktiga iakttagelser. Men sådan cellkultur analyser utförs under aeroba förhållanden som inte kan vara representativt för den in vivo-miljö. En viktig begränsning av in vitro-modeller används för att studera gastrointestinala infektioner är att odlingsbetingelser inklusive höga syrenivåer i allmänhet gynnar eukaryot cell överlevnad. Dock förhållandena i tarmlumen kommer att vara nästan anaeroba. Enteropatogener i en mycket låg syrehalt miljö uttrycka virulensgener vars uttryck förändras under aeroba förhållanden 2. Som sådan, erhölls data med hjälp av standard cellodling modeller may ge en felaktig indikation av bakteriella interaktioner med värdceller.
Campylobacter jejuni är den ledande smittämnen av bakteriell akut gastroenterit i världen, med symtom som varierar från mild diarré till svår inflammatorisk enterit. Majoriteten av C. jejuni infektioner resulterar i okomplicerad gastroenterit, men C. jejuni är också den vanligaste identifierade smittämnet i perifera neuropatier inklusive Guillain-Barrés syndrom (GBS). I Storbritannien, är det uppskattas att det finns över 500.000 fall av enterit orsakad av C. jejuni infektion varje år med en förväntad kostnad för den brittiska ekonomin på £ 580.000.000. I utvecklingsländerna, C. jejuni är en ledande orsak till dödlighet bland barn. Trots den obestridliga betydelse för Campylobacter-infektion och årtionden av forskning, inbegripet grundlig genomik-baserade analyser, C. jejuni patogenes är fortfarande dåligt understood, till skillnad från andra enterala patogener, såsom Salmonella, Escherichia coli, Shigella och Vibrio cholerae. Avsaknaden av en praktisk liten djurmodell är en viktig orsak till detta 3. Även den ofta används in vitro infektion modeller är mer olämplig för att studera mikroaerofil C. jejuni än för andra tarmpatogener som är fakultativa anaerober. Medan C. jejuni är erkänd som en invasiv patogen, mekanismerna för C. jejuni invasion av tarmepitelceller (IECS) är fortfarande oklart 4,5. C. jejuni invasion har visat sig vara beroende av antingen microfilaments, mikrotubuli, en kombination av båda eller ingen 5. Den förvirring i detta område är sannolikt beroende på användningen av olämplig in vitro analysbetingelser.
Ett antal olika cellodlingsanalyser har använts för att undersöka växelverkan av C. jejunimed värdceller. Caco-2 6, har INT 407 7, och T84 8 cellinjer alla använts för att studera adhesion och invasion hos olika C. jejuni-stammar. Emellertid, nivåerna av bakteriell adhesion och invasion för C. jejuni med IECS är dramatiskt lägre än för andra tarmpatogener 9. Den samodling av C. jejuni med IECS utförs normalt i en CO2-inkubator under betingelser nära atmosfäriska syrenivåer, krävs för överlevnaden av IECS. C. jejuni genuttryck kommer att vara mycket annorlunda i omgivning med låg syrehalt av intestinala lumen jämfört med atmosfäriska syreförhållanden.
Användningen av en vertikal diffusionskammare (VDC) har utvecklats som medger samodling av bakterier och värdceller under olika medellång och förhållanden gas 1,10,11. Detta system efterliknar förhållandena i den mänskliga tarmen där bakterier kommer att under förhållanden mycket låg syrehalt medan vävnad kommer förses med syrgas från blodet. Polariserade IEC monoskikt odlade i speciella 0,4 xm filter placerades i en VDC skapa en apikal och basolaterala fack, som var för sig fylldes med bakteriellt buljong och cellodlingsmedium respektive (Figur 1). Den VDC placerades i den variabla atmosfären inkubator innehållande 85% N 2, 5% O2, och 10% CO2 vid 37 ° C, som representerar optimala förhållanden för C. jejuni. Den apikala fack lämnades öppen och exponeras för mikroaerobisk atmosfären inuti den variabla atmosfären inkubatorn, medan det förseglade basolaterala facket var levereras med syre genom konstant administrering av 5% CO 2/95% O 2 gasblandning med ett utloppsrör förhindrar ackumulering av trycket . Caco-2-cell överlevnad och cellslager integritet under dessa betingelser bekräftades genom övervakning av transepithelial electrical motstånd (TEER) över monolagret över 24 timmar för att demonstrera överlevnad Caco-2 cellmonoskiktet och fysisk separation av de apikala och basolaterala fack under låga syreförhållanden i apikala facket. Den TEER av monoskikt i VDCs upprätthålls i variabeln atmosfären inkubator (mikroaerob förhållanden) och i en standard cellkultur CO2-inkubator (aeroba betingelser) visade inga signifikanta skillnader, vilket indikerar integritet av cellmonoskiktet under olika atmosfäriska förhållanden 1. Under mikroaerob förhållanden, fortsatt tight junctions närvarande och fördelas jämnt mellan de cellkantlinjer med en occludin färgningsmönster liknande celler upprätthålls under aeroba förhållanden 1.
De interaktioner C. jejuni med Caco-2 och T84 celler i VDC undersöktes genom att bedöma bakteriell interaktion (adhesion och invasion) och invasion. Två olika C. jejuni vildtyp strains användes 1. C. jejuni 11168H är en hypermotile derivat av den ursprungliga sekvensen stam NCTC11168. Den 11168H stammen visar mycket högre kolonisering nivåer i en chick kolonisering modell och betraktas därmed en lämplig stam att använda för värdpatogen interaktionsstudier. 81-176 är en mänsklig isolera och är en av de mest invasiva studerats ingående laboratoriestammar. C. jejuni-stammar tillsattes till den apikala avdelningen av en VDC under antingen mikroaerob eller aeroba förhållanden. Vi observerade högre priser för både interaktion och invasion registrerades för C. jejuni enligt mikroaerob villkor 1. Den ökade C. jejuni interaktioner inte var på grund av en ökning av antalet bakterier i mikroaerob villkor 1. Dessa data stöder vår hypotes att den omgivning med låg syrehalt i den apikala avdelningen av VDC förbättrar bakterier-värd interaktioner och indikerar att de invasiva egenskaper hos C. jejuni är incrlättade under dessa förhållanden. Detta var den första rapporten om användningen av VDC modell för att studera en invasiv bakteriell patogen och betonar betydelsen av att utföra in vitro infektion analyser under förhållanden som närmare efterlikna in vivo-situationen. VDC-modellen kan användas för att studera värd-patogen interaktioner för många olika bakteriearter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Användningen av cellodling in vitro metoder för att studera interaktioner mellan bakteriella patogener med värdceller är en teknik som ofta används i många forskningslaboratorier. Men som sådan cellkultur analyser utförs under aeroba förhållanden, dessa in vitro-modeller inte kan korrekt representera in vivo-miljö i vilken värdpatogen interaktion äger rum. Den används ofta in vitro infektion modeller är speciellt olämpligt för att studera mikroaerofil C. jejuni</e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dominic Mills fick stöd av ett Bloomsbury Högskolor doktorand (2007-2010). Författarna vill tacka både Ozan Gundogdu och Abdi Elmi för deras hjälp i utvecklingen av VDC-modeller.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts | Harvard Apparatus | 66-0001 | Manifold & six Snapwell chambers |
| Caps | Harvard Apparatus | 66-0020 | |
| O-rings | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
| Clamps | Harvard Apparatus | 66-0012 | |
| Snapwell filters (pore size 0.4 μm) | Corning Costar | 3407 | |
| Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter | Millipore | MERS00002 | |
| WPA Lightwave II spectrophotometer | Biochrom | 80-3003-72 |
References
- Mills, D. C., et al. Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment. Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).
- Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465, 355-358 (2010).
- Dorrell, N., Wren, B. W. The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems. Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).
- Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis. Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).
- Hu, L., Kopecko, D. J., Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. Chapter 17. Campylobacter. , 297-313 (2008).
- Everest, P. H., et al. Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli. J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).
- Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures. Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).
- Monteville, M. R., Konkel, M. E. Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface. Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).
- Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms. J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).
- Schuller, S., Phillips, A. D. Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells. Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).
- Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling. J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).
