Identifisere DNA Mutasjoner i Purified Hematopoietic Stem / stamceller

Summary

Her beskriver vi en in vivo-mutagenese assay for små antall av hematopoetiske celler renset ved hjelp av laci transgen musemodell. Den laci-genet kan bli isolert for å bestemme frekvensen, plasseringen og typen av DNA-mutanter spontant oppstått eller etter eksponering for genotoxins.

Abstract

I de senere årene har det blitt klart at genomisk ustabilitet er tett knyttet til mange utviklingsforstyrrelser, kreft, og aldring. Gitt at stamceller er ansvarlig for å sikre vev homeostase og reparasjon gjennom hele livet, er det rimelig å hypotese at stamcelle befolkningen er avgjørende for å bevare genomisk integritet av vev. Derfor har betydelig interesse oppstått i å vurdere virkningen av endogene og miljøfaktorer på genomisk integritet i stamceller og deres avkom, med formål å forstå etiologi av stamcellebaserte sykdommer.

Laci transgene mus som bærer et gjenvinnbart λ fag-vektor som koder for laci rapportørsystem, hvor laci-gen tjener som mutasjon reporter. Resultatet av en mutert laci-genet er produksjon av β-galaktosidase som kløyver et kromogent substrat, å dreie det blå. The Laci reporter systemet er gjennomført in alle cellene, inkludert stammen / stamceller og kan lett gjenvinnes og benyttes til senere å infisere E. coli. Etter inkubasjon infiserte E. coli på agarose som inneholder riktig underlaget, kan plaketter scores, blå plaketter indikerer en mutant Laci genet, mens klare plaketter havn villtype. Frekvensen av blått (blant klare plaques) indikerer den mutante frekvens i den opprinnelige cellepopulasjon DNA ble ekstrahert fra. Sekvensering av mutant laci-genet viser plasseringen av mutasjoner i genet og typen mutasjon.

The Laci transgen musemodell er godt etablert som en in vivo mutagenesetest. Videre, mus og reagensene for analysen er kommersielt tilgjengelige. Her beskriver i detalj hvordan denne modellen kan tilpasses for å måle frekvensen av spontant forekommende DNA-mutanter i stamcelle-anriket Lin ^– IL7R ^– Sca-1 ⁺ cKit ^{+ +} (LSK) celler og andre subpopulasjoner av den hematopoetiske system.

Introduction

I de fleste vev, differensierte celler har en begrenset levetid. For å opprettholde funksjonell integritet, lang levetid, vevsspesifikke stamceller produserer kontinuerlig progenitor-celler som i sin tur gir opphav til de fullt differensierte celler som er nødvendige for funksjonen av det aktuelle vev. Stamceller også fylle sin egen rommet gjennom en prosess som kalles selvfornyelse. Dermed stamceller er ansvarlig for å opprettholde den funksjonelle integritet av vevet de bor i. Derfor er det viktig at de er utstyrt med robuste mekanismer for å sanse og potensielt reparere skadet DNA. Hvis ikke, kan de skaffe seg flere genomisk (potensielt skadelige) forstyrrelser, som kan arves av deres avkom. Forstå hvordan stamceller ivareta deres genom under levetiden til en organisme er et viktig spørsmål og kan hjelpe oss å forstå hvorfor genomisk ustabilitet er knyttet til kreft og noen andre aldersrelaterte sykdommer (anmeldt i ^1,2).

<p class = "jove_content"> Styre genomisk integriteten til en vev på nivået av stamceller eller tidlige progenitorceller cellepopulasjoner kan oppnås enten ved å fjerne defekte stammen (eller progenitor) celler via celledød, senescence eller differensiering og / eller ved effektiv reparasjon av skadet DNA. Nyere studier har vist at det er mulig å måle visse typer DNA-reparasjon direkte i disse sjeldne populasjoner ^3-6. Det ble funnet at, for eksempel i det hematopoetiske system, dobbeltstrenget DNA bryter kan repareres ved hjelp av homolog rekombinasjon (HR) eller ikke-homolog ende sammenføyning (NHEJ), hvor sistnevnte er en reparasjonsprosess med lavere nøyaktighet, og derved øker risikoen for å gjøre feil. Begge blir utnyttet i blodkreft stamceller (HSCs) ^4,5, men i mus synes det det er overveiende NHEJ i HSCs mens tidlige stamceller celler benytter HR ^4. En lignende observasjon ble gjort for stamceller i huden ^6.. Interessant, i menneskelig HSCs HR, ikke NHEJ,synes å være reparasjonsmekanismen av valget for dobbel tråd pauser ^tre. Hvorvidt denne funksjonelle forskjell mellom de to artene er ekte eller bare representerer et teknologisk eller eksperimentell forskjell gjenstår å se.

En stamcelle repertoar å reparere skadet DNA er sannsynlig å inkludere andre DNA-reparasjonsmekanismer, som for eksempel grunn excision reparasjon (BER), nucleotide excision reparasjon (NER) og mismatch reparasjon (MMR). BER og NER er ansvarlig for å reparere én eller flere basepar lesjoner i enkelttrådet DNA, mens MMR fikser basen-base mismatch og innsetting / sletting sløyfer, og disse typer DNA-skader kan ikke repareres av NHEJ eller HR. Støtter denne oppfatningen er flere studier fra blodkreft systemet viser en kobling mellom endringer i en av disse banene og unormalt i HSC rommet ^7-9, samt en økt risiko for å utvikle myelodysplastisk syndrom ^10-16, en sykdom som oppstår iHSC og som er assosiert med økende genomisk ustabilitet som sykdommen utvikler ^17. Som foreløpig har målinger av BER, NER, og MMR direkte i HSCs ikke blitt rapportert.

I tillegg til å belyse de forskjellige prosesser som styrer vev integritet ved en mekanistisk nivå, er det viktig å være i stand til å måle omfanget av mutert DNA, slik at konsekvensene av forstyrrelser i en av disse prosessene kan bli testet, for eksempel i normal versus genetisk konstruerte stamceller eller i gamle kontra unge. Imidlertid er utviklingen av en relevant analysen vanskelig på grunn av mangelen på vevsspesifikke stamceller og mangelen på dyrkningsbetingelser som bevarer "stemness". Videre bør et slikt assay er amendable til miljø-og genetiske manipulasjoner. En mulig løsning på disse begrensninger og krav er bruk av musemodeller som er spesielt konstruert for å detektere DNA-mutasjoner.

Multiple transgene musemodeller for mutasjon deteksjon har blitt utviklet. For eksempel laci transgene mus ¹⁸ bærer et gjenvinnbart λ fag vektor som koder for laci rapportørsystem, hvor laci-genet koder for en suppressor av Lac operatøren og tjener som mutasjonen reporter. Ved mutasjon av laci-genet, blir Lac operatøren aktivert og β-galaktosidase fremstilles. β-galaktosidase spalter det kromogene substratet X-gal (5-brom-4-klor-e-indolyl-β-D-galaktopyranosid), som omdanner det blå. COS nettsider flankerer Laci vektor gir enkel gjenoppretting av lambda proteiner og påfølgende infeksjon av E. coli. Etter inkubasjon infiserte E. coli på agarose som inneholder X-gal underlaget, kan plakk scores. Blå plakater inneholde en antatt mutant Lac-Jeg bærer fag, mens klare plaketter båtplass ikke-mutanter. Hyppigheten av blå plaketter (blant the klare seg) indikerer den mutante frekvens i den opprinnelige cellepopulasjon DNA ble ekstrahert fra. Dessuten kan λ phage vert for laci target lett sekvensert ved hjelp av PCR-teknikker for relativt høy gjennomstrømning analyse. Sekvense flere mutant Laci gener vil avdekke viktig informasjon om mutasjonen spekteret, noe som igjen kan peke på mulige mangler i spesifikke DNA-reparasjonsbaner eller til bestemte gentoksiske hendelser. The Laci transgen systemet har blitt standardisert på tvers av flere laboratorier ¹⁹ og reagenser er tilgjengelig kommersielt. En stor ulempe med Laci systemet er begrenset evne til å oppdage store slettinger eller rearrangements, og derfor andre metoder, for eksempel multi-farge fisk på metafase sprer må brukes til å kompliment denne mangel.

Innenfor λ fagvektoren av laci mus modell, er det en mye mindre genet, CII, Fåes for mutasjonsanalyse. Dens størrelse og det faktum at mutanter kan velges gjør dette til en mindre arbeidskrevende og billigere assay ²⁰ enn laci-genet analyse. Imidlertid er laci-genet mer grundig studert for mutagenese ²¹ og følsomheten av genet for mutasjoner er blitt godt karakterisert, slik at det er en klar forståelse av de aminosyrerester som genererer et fenotypiske respons på et kromogent substrat ^22-25.

Andre musemodeller for mutasjon påvisning omfatter anvendelse av ΦX174 eller lacZ-transgener. Den ΦX174 transgen musemodell, med den opprinnelige A: T → G: C reversion mutasjonsanalyse ²⁶ eller den fremre mutasjonsanalyse ²⁷ som tillater påvisning av et spekter av basepar-substitusjoner, representerer et mindre kostbart system enn laci-modellen. Men, er ikke trivielt og mutasjonen spec den mutational skjermen i termin analysentrum av ΦX174 transgenet blir ikke så godt karakterisert som for laci. I musemodeller bærer LacZ transgener, er LacZ mutational reporter utvinnes utnytte E. coli-vertsceller som er sensitive for galaktose og medium inneholdende ²⁸ galaktose. En ulempe ved dette systemet er at gjenvinning av LacZ-målet omfatter også restriksjonsendonuklease digestion, fulgt av ligering og elektroporering i E. coli vert, og dermed gjøre det vanskelig å tilpasse systemet for et lite antall celler. Selv om det ikke er et absolutt krav for å arbeide med stammen / progenitor-cellepopulasjoner (man kan alltid starte med flere mus), hvis et stort antall celler er nødvendig (f.eks millioner eller mer), vil det raskt bli upraktisk og kost prohibitive. Også den forholdsvis store størrelse av LacZ, samtidig som det gir en sensitiv reporter mutasjons, er tungvint og mer kostbart for DNA-sekvensanalyse og determination av mutasjon spektra. En stor fordel ved denne modellen er imidlertid dens evne til å detektere store delesjoner og innføringer, samt kromosomale rearrangementer.

Ettersom alle cellene i laci, ΦX174 og lacZ-transgene musemodeller bære rapportørsystem, kan en hvilken som helst av disse musemodeller anvendes for å måle mutagenese i en hvilken som helst celletype av interesse, inkludert stamceller og progenitor-celler, så lenge de kan bli pålitelig høstes og i tilstrekkelig antall. Fordi vi hadde lang erfaring med Laci mus modell og Laci mutasjonsanalyse, bestemte vi oss for å satse på dette systemet videre for mutagenese analyse i blodkreft stilk og progenitor populasjoner.

Blodkreft vev er godt karakterisert i form av celleoverflaten fenotype av sine individuelle komponenter, inkludert langsiktige repopulating stamceller, som er gjenkjennelige til den ekstremt sjeldne bestanden av Lin ^– IL7R <sup> – Sca-1 ⁺ cKit ^{+ +} (LSK) / Flk2 ^– CD150 ⁺ CD48 ^– celler ^29. . Mohrin et al ⁴ viste at den litt større populasjon av LSK/Flk2 ^– cellene er fortsatt gode representanter for HSCs og signifikant forskjellig fra den mest primitive engasjerte myeloid progenitor (CMP) befolkningen når det gjelder å studere DNA-reparasjon. Dessuten, når HSC-beriket LSK (Flk-2 ⁺ og Flk-2 ^-) celler ble sammenlignet med Lin ^– IL7R ^– Sca-1-cKit ^{+ +} (LS-K stamceller), var det fortsatt en betydelig forskjell i NHEJ evne ⁵ mellom mindre rene, stamcelle-beriket LSK befolkningen og stamceller. I vår studie bruker vi HSC-beriket LSK (Flk-2 ⁺ og Flk-2 ^-) celler, fordi vi fant ut at minst 2 x 10 ⁵ celler er nødvendig for konsistente, pålitelige resultater i denne mutagenesetest; denne celle nummer er ekstremt vanskeligå få når man sorterer LSK/Flk2 ^– CD150 ⁺ CD48 befolkning eller selv LSK/Flk2 ^– befolkningen (i form av mus, kostnader og praktiske). Denne protokollen er basert på en opprinnelig utviklet av Kohler et al. ^18. beskriver i detalj hvordan den spontane DNA mutant frekvens kan bestemmes på LSK celler og definerte populasjoner av differensierte myeloide celler samt unseparated benmarg og miltceller.

Protocol

Leukocytter fra Laci transgene mus på en C57BL / 6 bakgrunnen uttrykker ikke Sca-en (figur 1). Derfor, hvis Sca-en er en markør som brukes for celle rensing, disse musene må krysses med en passende belastning å få Sca-ett uttrykk; i denne protokollen F1 av en krysning mellom vanlige C57BL / 6 (B6) mus og Laci (C57BL / 6) transgene mus (laci) ble benyttet (Figur 1). Av cellepopulasjoner som brukes i denne protokollen, LSKs og CMPS representerer de minste b…

Representative Results

In vivo mutagenesetest måler en sjelden hendelse (mutant PFUs) blant mange hendelser (alle PFUs). Ved å utføre analysen med et lite antall celler, er det mulig at resultatet blir betydelig påvirket av falske positive og falske negative resultater. For å løse dette problemet vi utført en seriell fortynning eksperiment med ufraksjonerte benmargceller, høstes fra tre forskjellige dyr. Vi målte mutant frekvens i benmarg hos disse dyr ved bruk av 1,4 x 10 6 7,0 x 10 5 3,5 x 10 <s…

Discussion

Den in vivo-mutagenese analysen beskrevet heri er basert på laci transgen musemodell som opprinnelig genereres av Kohler et al. ^18. Modellen benytter en λ phage vektor som bærer en laci reporter gen. De to cos områder flankerer vektoren muliggjøre en relativt enkel utvinning og etterfølgende innpakking i infeksiøse fag-partikler, som brukes til å infisere E. coli. En blå plaque vil bli generert av fag-infiserte E. coli som inneholder en m…

Materials

LacI transgenic mice	BioReliance Corporation
RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail	Agilent Technologies (Stratagene)	720202
Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli	Agilent Technologies (Stratagene)	200221
DNA size standards – lambda ladder	Bio Rad	170-3635
0.025 mM pore size membranes	Fisher (Millipore)	VSWP 025 00
245 mm2 bioassay dishes (trays)	Fisher (Corning)	07-200-600
NZY broth (powder)	Fisher (Teknova)	N1144
Agar	Fisher	BP1423-500
Agarose	Fisher	E-3120-500
N, N-dimethylformamide	Fisher	AC34843-5000
X-gal	Research Products Intl Corp (RPI)	B71800-10.0
Proteinase K	Roche	3-115-852
PCR Extender Taq Polimerase kit	5 PRIME	2200500
Agencourt AMPure XP cleanup kit	Beckman/coulter	A63880