L'identificazione del DNA Mutazioni in depurata ematopoietiche cellule staminali / progenitrici

Summary

Qui si descrive in vivo mutagenesi saggio per un piccolo numero di cellule ematopoietiche purificate utilizzando il modello di topo transgenico LacI. Il gene LacI può essere isolato per determinare la frequenza, la posizione ed il tipo di mutanti DNA sorto spontaneamente o dopo l'esposizione a genotossine.

Abstract

Negli ultimi anni, è diventato evidente che l'instabilità genomica è strettamente legata a molti disturbi dello sviluppo, tumori e invecchiamento. Dato che le cellule staminali sono responsabili di assicurare l'omeostasi dei tessuti e la riparazione per tutta la vita, è ragionevole ipotizzare che la popolazione di cellule staminali è fondamentale per preservare l'integrità genomica dei tessuti. Pertanto, notevole interesse è sorto nel valutare l'impatto di fattori endogeni ed ambientali sull'integrità del genoma nelle cellule staminali e la loro progenie, al fine di comprendere l'eziologia delle malattie a base di cellule staminali.

Laci topi transgenici portano un recuperabile vettore fago λ codificante il sistema giornalista LacI, in cui il gene LacI serve come il reporter mutazione. Il risultato di un gene mutato LacI è la produzione di β-galattosidasi che un substrato cromogenico, trasformandolo blu. Il sistema giornalista LacI i è effettuatan tutte le cellule, comprese le cellule staminali / progenitrici e può essere facilmente recuperati e utilizzati per infettare successivamente E. coli. Dopo aver incubato infetto E. coli su agarosio contenente il substrato corretta, placche può essere ottenuto; placche blu indicano un gene mutante LacI, mentre placche evidenti porto wild-type. La frequenza di blu (tra chiari) placche indica la frequenza nella popolazione mutante cella originale il DNA è stato estratto da. Sequenziamento del gene mutante LacI mostrerà la posizione delle mutazioni nel gene e il tipo di mutazione.

Il modello di topo transgenico LacI è ormai consolidata come un test in vivo mutagenesi. Inoltre, i topi ed i reagenti per il dosaggio sono disponibili in commercio. Qui si descrive in dettaglio come questo modello può essere adattato per misurare la frequenza di verificarsi spontaneamente mutanti di DNA in cellule staminali arricchita Lin ^– IL7R ^– Sca-1 ⁺ CKIT ^{+ +} (LSK) cellule e altri sottopopolazioni del sistema ematopoietico.

Introduction

Nella maggior parte dei tessuti, cellule differenziate hanno una durata limitata. Per mantenere l'integrità funzionale, le cellule staminali tessuto-specifiche a vita lunga continuamente producono cellule progenitrici che a loro volta danno origine alle cellule completamente differenziate necessari per la funzione di quel particolare tessuto. Le cellule staminali anche ricostituire il proprio scompartimento attraverso un processo chiamato auto-rinnovamento. Pertanto, le cellule staminali sono responsabili del mantenimento dell'integrità funzionale del tessuto in cui risiedono in Pertanto, è imperativo che essi sono dotati di meccanismi solidi di percepire e potenzialmente riparare il DNA danneggiato. In caso contrario, essi possono acquisire più perturbazioni (potenzialmente dannosi) genomiche, che possono essere ereditate dalla loro progenie. Capire come le cellule staminali salvaguardare il loro genoma durante la vita di un organismo è una questione importante e può aiutarci a capire perché l'instabilità genomica è collegata con il cancro e altre malattie legate all'età (recensiti ^1,2).

<p class = "jove_content"> Controllo dell'integrità genomica di un tessuto a livello delle cellule staminali o popolazioni di cellule progenitrici precoce può essere ottenuto sia eliminando stelo difettoso (o progenitore) cellule attraverso la morte cellulare, senescenza o differenziazione, e / o mediante riparazione efficiente DNA danneggiato. Recenti studi hanno dimostrato che è possibile misurare alcuni tipi di riparazione del DNA direttamente in queste rare popolazioni ^3-6. Si è constatato che, per esempio nel sistema ematopoietico, doppie rotture del DNA possono essere riparati mediante ricombinazione omologa (HR) o non omologhe fine unione (NHEJ), quest'ultimo è un processo di riparazione di bassa fedeltà e così aumentato rischio di fare errori. Entrambi vengono utilizzati nelle cellule staminali ematopoietiche (HSC) ^4,5, tuttavia, in topi sembra che prevalentemente NHEJ in CSE mentre le cellule progenitrici primi utilizzano HR ^4. Un'osservazione analoga è stata fatta per le cellule staminali della pelle ^6. È interessante notare che, in umana CSE HR, non NHEJ,sembra essere il meccanismo di riparazione di scelta per le pause doppio filamento ^3. Se questa differenza funzionale tra le due specie è reale o semplicemente rappresenta una differenza tecnologico o sperimentale resta da vedere.

Il repertorio di una cellula staminale per riparare il DNA danneggiato è probabile che includono altri meccanismi di riparazione del DNA, come riparazione per escissione di base (BER), riparazione per escissione del nucleotide (NER) e mismatch repair (MMR). BER e NER sono responsabili per la riparazione di lesioni singole o multiple di coppie di basi nel DNA a singolo filamento, mentre i disallineamenti correzioni MMR base-base e cicli di inserzione / delezione; questi tipi di danno al DNA non possono essere riparati da NHEJ o HR. A supporto di questa nozione sono diversi studi dal sistema ematopoietico dimostrare un legame fra alterazioni in uno di questi percorsi e anomalie nel vano HSC ^7-9, così come un aumentato rischio di sviluppare la sindrome mielodisplastica ^10-16, una malattia che ha origine nelHSC e che è associato con l'aumento dell'instabilità genomica come la malattia progredisce ^17. Come ancora, non sono stati segnalati misure di BER, NER, e MMR direttamente in CSE.

Oltre a chiarire i vari processi che controllano l'integrità del tessuto ad un livello meccanicistico, è indispensabile per poter misurare l'entità del DNA mutato, in modo che le conseguenze di aberrazioni in uno di questi processi possono essere testati, ad esempio in normali rispetto geneticamente cellule staminali ingegnerizzate o in vecchio contro giovane. Tuttavia, lo sviluppo di un saggio rilevante è difficile a causa della scarsità di cellule staminali tessuto-specifiche e la mancanza di condizioni di coltura che conservano "stemness". Inoltre, tale analisi deve essere modificabili a manipolazioni ambientali e genetici. Una possibile soluzione a queste limitazioni e prescrizioni è l'uso di modelli murini che specificamente sono progettati per rilevare mutazioni del DNA.

Mulsono stati sviluppati teplici modelli di topi transgenici per il rilevamento mutazione. Ad esempio, LacI topi transgenici ¹⁸ portano un recuperabile vettore fago λ codificante il sistema giornalista LacI, in cui il gene codifica una LacI soppressore dell'operatore Lac e serve come il reporter mutazione. Su mutazione del gene LacI, l'operatore Lac è attivato e β-galattosidasi viene prodotto. β-galattosidasi scinde il substrato cromogenico X-gal (5-bromo-4-cloro-e-indolil-β-D-galattopiranoside) che trasforma blu. Le cos siti che fiancheggiano il vettore LacI consente un facile recupero da parte lambda proteine ​​fagi e la successiva infezione di E. coli. Dopo aver incubato infetto E. coli su agarosio contenente il substrato X-gal, placche possono essere assegnati. Targhe blu contengono un mutante putativo Lac-I trasportano fago, mentre placche evidenti porto non-mutanti. La frequenza di placche blu (tra the quelli chiari) indica la frequenza nella popolazione mutante cella originale il DNA è stato estratto da. Inoltre, il fago λ ospita il bersaglio LacI può essere facilmente sequenziato utilizzando tecniche di PCR per l'analisi relativamente elevato rendimento. Sequenziamento geni multipli Laci mutanti rivelerà importanti informazioni sulla mutazione spettro, che a sua volta può indicare le eventuali carenze negli specifici percorsi di riparazione del DNA o per eventi specifici genotossici. Il sistema transgenico LacI è stato standardizzato su più laboratori ¹⁹ ei reagenti sono disponibili in commercio. Uno dei principali svantaggi del sistema LacI è la limitata capacità di rilevare grandi delezioni o riarrangiamenti, quindi, altri metodi, ad esempio FISH multi-colore su spread metafase devono essere utilizzati per completare questa carenza.

All'interno del vettore fago λ del modello murino LacI, c'è un gene molto più piccolo, CII, Disponibili per l'analisi di mutazione. Le sue dimensioni e il fatto che i mutanti possono essere selezionati rende questo un meno laborioso e più economico dosaggio ²⁰ rispetto all'analisi gene LacI. Tuttavia, il gene LacI è più ampiamente studiato per mutagenesi ²¹ e la sensibilità del gene per mutazioni è stata ben caratterizzata in modo che vi è una chiara comprensione dei residui amminoacidici che generano una risposta fenotipica su un substrato cromogenico ^22-25.

Altri modelli murini per la rilevazione di mutazione includono l'uso della ΦX174 o dei transgeni LacZ. Il ΦX174 modello di topo transgenico, con l'A originale: T → G: C mutazione reversione dosaggio ²⁶ o il forward test di mutazione ²⁷ che permette la rilevazione di uno spettro di sostituzioni di coppie di basi, rappresenta un sistema meno costoso rispetto al modello LacI. Comunque, la schermata mutazionale nel saggio in avanti non è banale e le specifiche mutazioneTrum del transgene ΦX174 non è come ben caratterizzata come quella del LacI. In modelli murini che trasportano transgeni LacZ, il giornalista mutazionale LacZ viene recuperato utilizzando E. cellule ospiti coli che sono sensibili al galattosio e terreno contenente galattosio ^28. Un inconveniente di questo sistema è che il recupero del bersaglio LacZ coinvolge anche la digestione di restrizione endonucleasi seguita da ligazione ed elettroporazione di E. coli ospita, rendendo così difficile adattare il sistema per un piccolo numero di cellule. Anche se non è un requisito assoluto per lavorare con popolazioni di cellule staminali / progenitrici (si può sempre iniziare con più topi), se un gran numero di cellule sono necessari (ad es milioni o più) diventa subito poco pratico e un costo proibitivo. Inoltre, le dimensioni relativamente grandi di LacZ, fornendo un reporter mutazionale sensibile, è ingombrante e costosa per l'analisi di sequenza del DNA e determminazione degli spettri mutazione. Uno dei principali vantaggi di questo modello tuttavia, è la sua capacità di rilevare grandi delezioni e inserzioni, nonché riarrangiamenti cromosomici.

Poiché tutte le cellule in modelli murini transgenici LacI, ΦX174 e LacZ portano il sistema giornalista, uno di questi modelli mouse può essere utilizzato per misurare la mutagenesi in qualsiasi tipo di cellula di interesse, comprese le cellule staminali e progenitrici, fintanto che possono essere raccolte in modo affidabile e in numero sufficiente. Perché abbiamo avuto una vasta esperienza con il modello del mouse LacI e il test di mutazione LacI, abbiamo deciso di perseguire questo ulteriore sistema per l'analisi di mutagenesi in staminali ematopoietiche e le popolazioni progenitrici.

Il tessuto emopoietico è ben caratterizzato in termini di superficie delle cellule fenotipo dei suoi singoli componenti, tra cui ripopolamento cellule staminali-lungo termine, che sono identificabili come la popolazione estremamente rara di Lin ^– IL7R <sup> – Sca-1 ⁺ CKIT ^{+ +} (TSS) / Flk2 ^– CD150 ⁺ CD48 ^{– 29} cellule. . Mohrin et al ⁴ hanno dimostrato che la popolazione leggermente più grande di LSK/Flk2 ^– le cellule sono ancora buoni rappresentanti per CSE e significativamente diversa da quella più primitiva impegnati progenitore mieloide (CMP) della popolazione quando si tratta di studiare la riparazione del DNA. Inoltre, quando la LSK HSC-arricchito (Flk-2 ⁺ e Flk-2 ^-) le cellule sono state confrontate con la Lin ^– IL7R ^– Sca-1-CKIT ^{+ +} (cellule progenitrici LS-K), c'era ancora una differenza significativa in NHEJ capacità di ⁵ tra i meno puro, staminali popolazione di TSS cellule arricchito e le cellule progenitrici. Nel nostro studio utilizziamo HSC-arricchito LSK (Flk-2 ⁺ e Flk-2 ^-), le cellule, perché abbiamo scoperto che almeno 2 x 10 ⁵ cellule sono necessari per risultati coerenti e affidabili in questo test di mutagenesi, questo numero di cellulare è estremamente difficileavere quando si ordina la LSK/Flk2 ^– popolazione CD150 ⁺ CD48 o anche il LSK/Flk2 ^– della popolazione (in termini di topi, costi e praticità). Tale protocollo, basata su quella originariamente sviluppata da Kohler et al. ¹⁸ descrive in dettaglio come la frequenza DNA mutante spontaneo può essere determinata in cellule LSK e popolazioni di cellule mieloidi differenziate così come le cellule del midollo osseo non separato e milza definito.

Protocol

Leucociti dal LacI topi transgenici su un C57BL / 6 sfondo non esprimono Sca-1 (Figura 1). Pertanto, se Sca-1 è un indicatore utilizzato per la purificazione delle cellule, questi topi devono essere attraversato con un ceppo appropriato per ottenere Sca-1, in questo protocollo F1 di un incrocio tra regolari C57BL / 6 (B6) topi e LacI (C57BL / 6) topi transgenici (LacI) è stato usato (Figura 1). Delle popolazioni di cellule utilizzate in questo protocollo, LS…

Representative Results

Il test in vivo mutagenesi misura un evento raro (mutante PFUs) tra i molti eventi (tutto PFUs). Eseguendo i test con piccolo numero di celle, è possibile che il risultato è notevolmente influenzata da risultati falsi positivi e falsi negativi. Per risolvere questo problema abbiamo effettuato un esperimento di diluizione seriale con cellule del midollo osseo non frazionata, raccolte dalle tre diversi animali. Abbiamo misurato la frequenza dei mutanti nel midollo osseo di questi animali con 1,4 x 10 <sup…

Discussion

Il test in vivo mutagenesi qui descritta si basa sul modello di topo transgenico LacI originariamente generato da Kohler et al. ¹⁸ Questo modello utilizza un vettore fagico λ trasportano un gene reporter lacI. I due siti cos fiancheggianti il vettore consentire un recupero relativamente semplice e successivo confezionamento in particelle fagiche infettive, utilizzati per infettare E. coli. Una targa blu sarà generato da fago-infetti E. coli che …

Materials

LacI transgenic mice	BioReliance Corporation
RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail	Agilent Technologies (Stratagene)	720202
Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli	Agilent Technologies (Stratagene)	200221
DNA size standards – lambda ladder	Bio Rad	170-3635
0.025 mM pore size membranes	Fisher (Millipore)	VSWP 025 00
245 mm2 bioassay dishes (trays)	Fisher (Corning)	07-200-600
NZY broth (powder)	Fisher (Teknova)	N1144
Agar	Fisher	BP1423-500
Agarose	Fisher	E-3120-500
N, N-dimethylformamide	Fisher	AC34843-5000
X-gal	Research Products Intl Corp (RPI)	B71800-10.0
Proteinase K	Roche	3-115-852
PCR Extender Taq Polimerase kit	5 PRIME	2200500
Agencourt AMPure XP cleanup kit	Beckman/coulter	A63880