인간 호흡기 세포융합 바이러스(HRSV)는 어린 유아에게 심각한 세기관지염을 유발할 수 있습니다. 중증 HRSV 질환의 발병 기전 중 일부는 숙주 면역 반응에 의해 발생합니다. HRSV를 이용한 일차 인간 면역 세포의 자극은 염증 경로 및 감염의 활성화를 연구하기 위한 빠르고 재현 가능한 모델 시스템을 제공합니다.
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방법 논문
인간 호흡기 세포융합 바이러스 감염에 대한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 면역 반응을 연구하기 위한 체외 모델
이 논문에서
요약
초록
인간 호흡기 세포융합 바이러스(HRSV) 감염은 경미한 감염에서 생명을 위협하는 세기관지염에 이르기까지 광범위한 질병 중증도를 나타냅니다. 중증 질환의 발병 기전에서 중요한 부분은 면역 병리학을 유발하는 향상된 면역 반응입니다.
여기에서는 HRSV 감염에 대한 인간 면역 세포의 면역 반응을 조사하는 데 사용되는 프로토콜에 대해 설명합니다. 먼저 HRSV의 배양, 정제 및 정량화에 사용되는 방법을 설명합니다. 그 후, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)가 살아있는 HRSV로 자극되는 인간 체외 모델에 대해 설명합니다. 이 모델 시스템은 선천성 및 적응 면역 반응을 포함하여 질병 중증도에 기여할 수 있는 여러 매개변수를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 반응은 전사 및 번역 수준에서 측정할 수 있습니다. 또한 세포의 바이러스 감염은 유세포 분석을 사용하여 쉽게 측정할 수 있습니다. 종합하면, 살아있는 HRSV를 통한 PBMC의 자극은 HRSV 유발 질환과 관련된 메커니즘을 조사하기 위한 빠르고 재현 가능한 모델 시스템을 제공합니다.
서론
인간 호흡기 세포융합 바이러스(HRSV)는 어린이의 하기도 감염의 가장 흔한 원인입니다. 매년 5세 미만 아동 3,300만 명 이상이 HRSV에 감염되어 300만 명 이상이 입원하고 약 20만 명이 사망합니다1. HRSV가 기저 만성 질환을 앓고 있는 노인과 성인에게도 상당한 위협이 된다는 증거가 점점 늘어나고 있다2.
소아에서 발생하는 대부분의 HRSV 감염은 일반 감기에 필적하는 경미한 증상을 보이며 임상적 개입이 필요하지 않습니다. 그러나 소수의 환자는 심각한 세기관지염으로 인해 입원과 기계 환기가 필요합니다.
HRSV 질병의 발병 기전 중 일부는 감염에 대한 숙주의 과잉적이고 부적절한 면역 반응입니다3,4. 이것은 몇 가지 관찰에 의해 설명됩니다. 최대 질환 기간은 바이러스 감염이 최고조에 달하기 전에 발생하는 경우가 많으며, 감염된 조직의 세포 침투 및 염증성 사이토카인(cytokine)의 방출과 더 잘 일치한다3. 또 다른 증거는 1960년대의 포르말린 불활성화 HRSV(FI-RSV) 임상시험에서 비롯되었습니다. 백신은 어린 영아에게 보호를 유도하는 대신 면역 반응을 과장하여 호흡기 질환을 강화하고 이환율....
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프로토콜
참고:
HRSV를 이용한 실험은 생물안전 2등급(BSL-2) 실험실의 생물안전작업대 내에서 수행해야 합니다. 생물학적 위험으로 인해 바이러스성 폐기물 및 바이러스와 접촉한 모든 재료는 적절한 폐기를 위해 수거하십시오.
감염 가능성이 있는 인간 혈액을 사용할 때는 특별한 주의를 기울여야 합니다.
모든 프로토콜 전반에 걸쳐 엔도톡신이 없는 시약을 사용하는 것이 매우 중요합니다.
1. HRSV A2의 배양
- HeLa 또는 HEp-2 세포를 10% 태아 송아지 혈청(FCS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 첨가된 DMEM 배지에서 175 cm² 배양 접시에 배양한다.2 세포가 약 50% 정도 합쳐질 때까지 배양 플라스크에서 배양합니다.
- 실온의 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline)로 세포를 3회 세척하십시오. (PBS).
- HRSV 시딩 스톡 바이러스가 들어 있는 바이알을 다음 온도에서 해동하십시오. 37 °C 항온수조에서 처리하십시오. MOI를 0.1 이하로 유지하도록....
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결과
여기에 기술된 HRSV A2 배양 및 정제 방법은 ml당 2 x 107에서 2 x 108의 FITC-50 정량 감염성 바이러스 입자 수율을 제공합니다. FITC로 염색된 감염 세포를 계수하여 얻은 현미경 분석 결과(결과 미제시)를 FACS 정량 결과(그림 1)와 비교하였습니다. 두 방법 모두 유사한 역가가 도출되었으나, FACS 방법이 서로 다른 실험 간의 표준 편차가 훨씬 낮았고 노동력이 덜 소모되었습니다.
PBMC 자극 실험을 수행할 때는 자극-분할법(stimuli-fraction method)을 사용하는 것을 권장합니다. 이 방법에서는 조건을 자극 조건과 분할 조건으로 나눕니다(그림 2). 자극 조건은 표준 조건(예: RPMI 및 HRSV)입니다. 분할 조건은 테스트 조건(예: RPMI, MDP 및 LPS)입니다. 각 실험에는 항상 음성 대조군.......
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토론
이 연구에서 우리는 HRSV에 의한 PBMC 감염이 염증 경로를 연구할 수 있는 빠르고 신뢰할 수 있는 모델 시스템임을 보여줍니다. PBMC를 자극하려면 HRSV 스톡을 준비하고 정량화해야 합니다.
여러 세포주가 HRSV 감염에 취약합니다. HRSV 배양에 가장 많이 사용되는 세포주는 HEp-2, HeLa 및 Vero 세포입니다. 그러나 Vero 세포에서 HRSV를 배양하면 HRSV10의 G-단백질이 잘리는 것으로 나타났기 때문에 HRSV 배양에 Vero 세포의 사용을 권장하지 않습니다. 또한, 결함이 있는 간섭 입자를 생성할 위험이 있으므로 배양을 위해 세포를 감염시키기 위해 항상 적은 양의 바이러스를 사용하십시오11. 결함 간섭 입자(DIP)는 게놈의 일부 또는 전부를 놓친 바이러스 입자입니다. 따라서 DIP는 스스로 감염을 지속할 수 없으며 감염성 바이러스에 의존할 수 있습니다. 게놈이 작기 때문에 완전한 기능을 갖춘 바이러스보다 더 .......
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공개 사항
우리는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
RSV A2는 R. de Swart 박사(Erasmus MC, Rotterdam, The Netherlands)가 친절하게 제공했습니다. MV 및 GF는 네덜란드 정부 프로젝트 번호 FES0908와 네덜란드 유전체학 이니셔티브(NGI) 프로젝트 번호 050-060-452의 자금 지원을 받는 Virgo 컨소시엄의 지원을 받습니다. 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 | |||
| PBS | Lonza | BE17-516F | PBS without Ca2+ Mg2+ 또는 페놀 레드 |
| HBSS | Invitrogen | 14025-100 | HBSS, 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드 |
| DMEM | 없음 Invitrogen | 31966-047 | DMEM, 고포도당, 글루타MAX, 피루베이트 |
| RPMI | Invitrogen | 72400054 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX, HEPES |
| Reduced Serum Medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 51985-026 | Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX |
| FCS | Greiner Bio-one | FBS (Fetal Bovine Serum) | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7030 | 소 혈청 |
| P/S | Invitrogen | 15140-122 | 페니실린-스트렙토마이신, 액체 |
| 트립신 | 인비트로겐 | 25300-054 | 0.05% 트립신-EDTA (1x), 페놀 레드 |
| HeLa 세포 | ATCC | CCL-2 | |
| A549 세포 | ATCC | CCL-185 | |
| 자당 | 시그마 알드리치 | S7903 | 자당 BioXtra, ≥ 99.5% |
| IgG2 안티-마우스-FITC | BD 파밍겐 | 555057 | Ms IgG2b K FITC 이소타입 제어 |
| 안티-NP-RSV-FITC | Abcam | ab25849 | 안티-호흡기 세포융합 바이러스 항체 [671] (FITC) |
| 밀도 구배 매체(림프렙) | 축 쉴드 | 1114545 | |
| EDTA 튜브 | BD Biosciences | 367525 | |
| Acetone | Merck Millipore | 1000141000 | 분석 |
| Material | |||
| Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 Thinwall, Polyallomer, 38.5 ml, 25 mm x 89 mm | |
| SureSpin 630 Rotor with 36 ml bucket | Sorvall | 79368 | 스윙 버킷 티타늄 로터 |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Sorvall | 46900 | |
| CB 150l CO2 인큐베이터 | 바인더 | ||
참고문헌
- Nair, H., Nokes, D. J., et al. Global burden of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children: a systematic review and meta-analysis. Lancet. 375, 1545-1555 (2010).
- Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E.
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재인쇄 및 허가
