Reversibly छोटे अणुओं या Biosensor अनुप्रयोगों के लिए बहु घटक संरचनाएं स्थिर microfluidic पर चिप कब्जा cycloaddition के रिएक्शन
Summary
हम अनुक्रमिक पर चिप bioorthogonal cycloaddition के रसायन शास्त्र और एंटीबॉडी प्रतिजन कब्जा का उपयोग, छोटे अणुओं की तेजी, प्रतिवर्ती स्थिरीकरण और सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर) के अध्ययन के लिए क्रियाशील nanoparticle विधानसभाओं के लिए एक तरीका मौजूद है.
Abstract
अभिविन्यास और स्थिरीकरण घनत्व पर नियंत्रण के साथ bioactive छोटे अणुओं की तेजी से सतह स्थिरीकरण के लिए तरीके biosensor और माइक्रोएरे अनुप्रयोगों के लिए अति आवश्यक हैं. इस अध्ययन में, हम TCO / TZ-derivatized अणुओं की microfluidic स्थिरीकरण सक्षम करने के लिए एक अत्यधिक कुशल सहसंयोजक bioorthogonal पार cyclooctene (TCO) के बीच [4 2] cycloaddition प्रतिक्रिया और 1,2,4,5-tetrazine (Tz) का उपयोग करें . हम सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर) का उपयोग निरंतर प्रवाह परिस्थितियों में वास्तविक समय में प्रक्रिया की निगरानी. प्रतिवर्ती स्थिरीकरण सक्षम और सतह सेंसर की प्रयोगात्मक सीमा का विस्तार करने के लिए, हम cycloaddition प्रतिक्रिया के साथ एक गैर सहसंयोजक प्रतिजन प्रतिरक्षी कब्जा घटक गठबंधन. बारी – बारी से सेंसर सतह को TCO या Tz moieties पेश करके, एकाधिक कब्जा cycloaddition प्रक्रियाओं बहु घटक संरचनाओं की एक किस्म पर चिप विधानसभा और बातचीत के अध्ययन के लिए एक संवेदक सतह पर अब संभव है. हम मैंएक छोटा सा अणु, FK506 बाध्यकारी प्रोटीन 12 (FKBP12) कि बांध AP1497; दो एक biosensor चिप पर अलग स्थिरीकरण प्रयोगों के साथ इस पद्धति llustrate और एक ही छोटे अणु एक स्थिर और में सीटू-क्रियाशील nanoparticle के हिस्से के रूप में.
Introduction
कुशल संयोजन प्रतिक्रियाओं जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए सतहों को bioactive अणुओं संलग्न करने के लिए मूल्यवान उपकरण हैं. हाल ही में, बहुत तेजी से bioorthogonal पार cyclooctene (TCO) के बीच [4 2] cycloaddition प्रतिक्रिया और 1,2,4,5-tetrazine (Tz) सेल सतहों, subcellular संरचनाओं, एंटीबॉडी और नैनोकणों लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है 1. – यहाँ 7, हम सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर) बातचीत के विश्लेषण के लिए बहु – घटक संरचनाओं की प्रतिवर्ती पर चिप संश्लेषण के लिए प्रतिजन / एंटीबॉडी कब्जा (जीएसटी / विरोधी जीएसटी) के साथ संयोजन में [4 2] cycloaddition प्रतिक्रिया का उपयोग और निगरानी वास्तविक समय में प्रक्रिया (चित्रा 1). नई परख की विविधता के लिए ligand अभिविन्यास और घनत्व पर नियंत्रण के साथ स्थिर सेंसर सतहों का एक परिणाम, विधानसभा के रूप में 8,9 विशेष रूप से, कब्जा cycloaddition रणनीति एक स्थापित प्रोटोकॉल का उपयोग कर सतह उत्थान में सक्षम बनाता है. 8 स्वरूपों अब संभव है. का प्रयोगइस रणनीति हम TCO / TZ-derivatized छोटे अणुओं के स्थिरीकरण का प्रदर्शन और बफर स्थितियों की एक किस्म में cycloaddition दरों की विशेषताएँ. हम या तो सीधे immobilized जीएसटी एंटीजन को संलग्न जब कब्जा cycloaddition रणनीति अपने लक्ष्य के साथ बातचीत करने के लिए छोटे अणु की क्षमता को बरकरार रखता है, इसकी पुष्टि करने के लिए एक उदाहरण के रूप FKBP12 10-12 कि बांध FKBP12 और एक अणु AP1497 के बीच प्रसिद्ध बातचीत चुना या immobilized नैनोकणों (एनपीएस) के लिए.
यह विधि कई लाभ प्रदान करता है. सबसे पहले, संवेदक चिप्स पर छोटे अणुओं की प्रतिवर्ती गतिहीनता संभव है. दूसरा, छोटे अणुओं की TCO / Tz स्थिरीकरण भी विहित एसपीआर पढ़ाई के उन्मुखीकरण को उल्टा उस लेबल से मुक्त बातचीत पढ़ाई सक्षम बनाता है, और एक बाध्यकारी बातचीत का एक पूरक दृश्य प्रदान कर सकते हैं. तीसरा, इस विधि लक्षित नैनोकणों के microfluidic संश्लेषण, और उनके bindin का तत्काल मूल्यांकन के लिए सक्षम बनाता हैजी गुण. यह लक्षित नैनोकणों के मूल्यांकन या स्क्रीनिंग की दक्षता में सुधार, और भी आवश्यक नैनोकणों की मात्रा में कमी करने का वादा किया. चौथा 13-15, इस दृष्टिकोण निरंतर प्रवाह के तहत वास्तविक समय में bioorthogonal cycloaddition प्रतिक्रियाओं की प्रतिक्रिया कैनेटीक्स उपाय कर सकते हैं. अंत में, TCO / Tz स्थिरीकरण रसायन विज्ञान सीरम की उपस्थिति में मजबूत है. साथ में ले ली, हम इस बहुमुखी दृष्टिकोण मोटे तौर पर इन विट्रो और इन विवो सेलुलर अनुप्रयोगों में करने के लिए प्रासंगिकता के साथ microfluidic अध्ययन की एक विस्तृत विविधता के लिए स्थिर सेंसर सतहों के निर्माण की सुविधा करेंगे.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित कब्जा cycloaddition विधि लेबल से मुक्त चिप आधारित बातचीत और गतिज अध्ययन के लिए संशोधित नैनोकणों और छोटे अणुओं की तेजी, प्रतिवर्ती स्थिरीकरण सक्षम बनाता है. स्थिरीकरण प्रोटोकॉल <छोटे अणु ligands की 10 मा…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एनआईएच (NHLBI अनुबंध नहीं HHSN268201000044C, एसएच और SYS आरडब्ल्यू के लिए) से धन स्वीकार करते हैं.
Materials
| Reagent | |||
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1005-30 | |
| Amine coupling kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| GST capture kit | GE Healthcare | BR-1002-23 | |
| NAP-10 Columns | GE Healthcare | 17-0854-01 | |
| GST, lyophilized in 1X PBS | Genscript | Z02039 | 1 mg/ml |
| rhFKBP12 | R&D Systems | 3777-FK | |
| Surfactant P-20 | GE Healthcare | BR-1000-54 | |
| Glycine 2.0 | GE Healthcare | BR-1003-55 | |
| Zeba spin desalting column | Thermo | 89882 | 7 K MWCO |
| Amicon Ultra 4 | Fisher | UFC810096 | 100 K centrifugal filter |
| TCO-OH | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| TCO-NHS | Ref. 8 | Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25 | |
| Tz-BnNH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Tz-NHS | Ref. 8 | 764701 | Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701 |
| NP-NH2 = CLIO-NH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| AP1497, AP1497-Tz | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Equipment | |||
| SPR Biosensor | GE Healthcare | Biacore T100 |
References
- Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry. ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).
- Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).
- Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells. J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection. Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).
- Liong, M., et al. Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance. Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).
- Tassa, C., et al. On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics. Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).
- Pol, E. The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis. J Vis Exp. (37), e1746 (2010).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
- Ong, S. E., et al. Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).
- Tassa, C., et al. Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles. Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).
- Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).
- Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol. Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).
- Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).
- Keelan, J. A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta. Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).
- Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).
- Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study. ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).
- Mammen, M., Choi, S. -. K., Whitesides, G. M. Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).
- Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor. Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).
- Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).
- Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors. J Med Chem. 51, 574-580 (2008).
- Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face. Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).
- GE Healthcare. . Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. , (2005).
