Préparation de neurones primaires pour visualiser Neurites à l'état congelé-hydraté utilisant microscopie cryo-électronique
Summary
Afin de préserver les processus neuronaux pour l'analyse ultrastructurale, nous décrivons un protocole pour le placage de neurones primaires sur des grilles de microscopie électronique suivies par la congélation instantanée, ce qui donne des échantillons en suspension dans une couche de glace vitreuse. Ces échantillons peuvent être examinés avec un microscope cryo-électronique pour visualiser les structures à l'échelle nanométrique.
Abstract
Neurites, les dendrites et les axones, sont des processus cellulaires neuronales qui permettent la conduction des impulsions électriques entre les neurones. Définition de la structure des neurites est essentielle pour comprendre comment ces processus qui déplacent des matières et des signaux qui facilitent la communication synaptique. microscopie électronique (EM) a été traditionnellement utilisé pour évaluer les caractéristiques ultrastructurales dans neurites, mais l'exposition au solvant organique lors de la déshydratation et l'incorporation de résine peut fausser les structures. Un objectif important non satisfait est la formulation de procédures qui permettent des évaluations structurelles pas touchés par ces objets. Ici, nous avons établi un protocole détaillé et reproductible pour la croissance et entières neurites flash-gel des différents neurones primaires sur des grilles de microscopie électronique suivie de leur examen à la tomographie cryo-électronique (cryo-ET). Cette technique permet la visualisation en 3-D de neurites, hydratés-congelés à résolution nanométrique, facilitant assessment de leurs différences morphologiques. Notre protocole donne une vue sans précédent du ganglion de racine dorsale (DRG) neurites, et une visualisation des neurites de l'hippocampe dans leur état quasi-native. En tant que tel, ces méthodes créent une fondation pour les études futures sur neurites des deux neurones normaux et ceux qui sont touchés par des troubles neurologiques.
Introduction
Les neurones établissent l'essentiel des circuits complexes de la fonction des systèmes nerveux central et périphérique, par l'élaboration de dendrites et des axones recevoir des informations, souvent assez volumineux, de communiquer avec des neurones en aval. L'extension des neurites joue un rôle fondamental pendant le développement embryonnaire et la différenciation neuronale et la maintenance des neurites soutient de manière critique de la fonction du système nerveux. Processus séniles également critique dans les lésions neuronales et de régénération, ainsi que des troubles du système nerveux. L'étude de l'architecture neuronale est crucial de comprendre à la fois le cerveau normal et pathologique. Heureusement, les systèmes de culture de cellules neuronales physiologiquement pertinentes existent qui peuvent récapituler structures cellulaires complexes et hétérogènes. Basé sur l'élucidation des plates-formes expérimentales solides, des stratégies de visualisation efficaces qui permettent des analyses qualitatives et quantitatives de la morphologie des neurones sont nécessaires. Particulièrement utile seraitune méthodologie détaillée qui fournit une plate-forme uniforme pour la visualisation de neurites, les axones et les dendrites à l'échelle du nanomètre.
Microscopie électronique traditionnelle nécessite l'utilisation de solvant organique lors de la déshydratation et l'incorporation de résine, ce qui peut induire des distorsions dans les spécimens de leur véritable état. À ce jour, la plupart des caractérisations structurales à l'échelle du nanomètre sont basées sur des cellules plus grandes ou des tissus qui sont soumis à ces produits chimiques agressifs – limitant ainsi l'interprétation des résultats 4,9,25. De plus, pour la pénétration du faisceau d'électrons, le sectionnement est requis pour les organismes cellulaires ou de saillies présentant une épaisseur supérieure à 1 um 12. Enfin, en coupe ou fraisage résultats de tissus dans la collection d'ensembles de données spécifiques aux tranches discrètes, ce qui rend fastidieux la définition de la fonction de forme allongée de neurites. Même pour cryo-EM, dans lequel la coupe d'un échantillon congelé-hydraté est possible, la méthode présente compression artifagit 1.
Au cours des dernières années, les chercheurs ont appris à cultiver des neurones d'hippocampe directement sur les grilles EM et le flash-gel dans les éthane liquide pour visualiser la suite neurites en utilisant cryo-ET 8,10,18,23. Toutefois, ces études utilisent soit un dispositif sur mesure 10,23, ou le manque de détails sur l'étape buvard pour générer suffisamment de glace vitreuse mince pour la visualisation de routine 8,18. Par exemple, une étude recommande l'utilisation de 30-40 secondes pour buvard la grille EM 10, mais cette valeur est optimisée pas pour un usage général, mais est spécifique à ce dispositif de plongée gel sur mesure. L'utilisation d'un dispositif sur mesure plutôt que disponible dans le commerce 17 pour maintenir l'humidité avant de plonger au point de congélation de l'échantillon pourrait constituer un obstacle pour la reproductibilité généralisée.
Bien que ces études ont été révolutionnaire dans la visualisation de neurites par cryo-ET, nous avons franchi une nouvelle étape pour explorer l'APplicability de cryo-ET à une variété de spécimens neuronales (neurones de l'hippocampe et le ganglion de la racine dorsale). De plus, nous discutons de deux résultats optimaux et sous-optimaux, ainsi que les artefacts potentiels que l'on peut rencontrer en utilisant cryo-ET pour ces spécimens.
Définition d'une technique détaillé pour la préservation et la visualisation des neurites entiers à l'échelle du nanomètre dans un état quasi-native serait de renforcer la capacité pour plus de chercheurs de mener des études ultrastructurales. À cette fin, nous décrivons un protocole efficace et détaillée en utilisant un équipement disponible dans le commerce pour préparer non fixées, les neurones non colorées pour visualiser neurites. Il s'agit d'une première étape importante vers détaillant l'ultrastructure des neurites en bonne santé et de jeter les bases pour comprendre ce que les différences structurelles sont présents dans des modèles de maladies du système nerveux. Depuis cryo-ET peut résoudre non fixées, les caractéristiques de neurites non colorées en 3-D à l'échelle du nanomètre, la méthode permettant de ne jamais êtreavant de définir l'architecture neuritique 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous montrons que le rat neurones embryonnaires (ganglionnaires de la racine dorsale et l'hippocampe) peuvent être cultivées en microscopie électronique or (EM) des grilles et dans la glace vitreuse suffisamment minces pour leurs neurites être imagées à l'aide de 2-D cryo-EM et 3-D cryo- ET. Alors que neurites hippocampe ont déjà été imagées en utilisant cryo-ET 8,10,18,23, un protocole suffisamment détaillée pour reproduire avec succès en utilisant des dispositifs disponibles dans le co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par les subventions des NIH (PN2EY016525 et P41GM103832). SHS a été soutenue par une bourse du Programme du Centre interdisciplinaire de WM Keck Bioscience formation de la Côte du Golfe consortiums (NIH Grant No. T32EB009379) de formation supérieure nanobiologie interdisciplinaire.
SHS disséqué, a grandi et DRG et les cellules de l'hippocampe vitrifié; recueilli cryo-EM et données cryo-ET de DRG et les axones de l'hippocampe; reconstruit et couleur annoté de la série d'inclinaison. MRG disséqué et fourni cellules de l'hippocampe dans le laboratoire du MRN. SC assistée en série d'inclinaison annotation. SHS a été formé par CW sur la façon de disséquer et de grandir neurones. SHS, WCM et WC conçus les expériences. SHS a préparé le manuscrit avec la participation d'autres auteurs.
Cette vidéo a été filmée au Centre d'imagerie cellulaire et NanoAnalytics (C-CINA) du Biozentrum de til l'Université de Bâle. C-CINA est intégré dans le Département des biosystèmes (D-BSSE) de l'EPF de Zurich, situé à Bâle, en Suisse.
Materials
| Dumont #7 Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72803-01 | For handling EM grids |
| Glass bottom dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | For growing sample |
| Electron microscopy grids | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | For growing sample |
| Calcium-free filter paper | Whatman | 1541-055 | For blotting sample |
| Large flat point long tweezers | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | For blotting sample |
| Vitrification device and tweezers | FEI | Vitrobot Mark III | For freezing sample |
| Mini grid storage boxes | Ted Pella, Inc. | 160-40 | For storing EM grids |
| Cryo transfer holder | Gatan | 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder | For imaging samples |
| Semi-automated tilt series acquisition software | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | For imaging samples |
| Image processing software | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | For image processing |
| Transmission electron microscope for cryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope | For imaging samples |
| 4k x 4k CCD camera | Gatan | N/A | For imaging samples |
| 3-D annotation software | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | For processing 3-D data |
| Software for digitally stitching 2-D images | Adobe | Adobe Photoshop | For processing 2-D data |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | For hippocampal culture |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B-0252 | For hippocampal culture |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | B-9876 | For hippocampal culture |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | For hippocampal culture |
| Filter system | Corning | 430758 | For hippocampal culture |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | For DRG culture |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | For DRG culture |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | For DRG culture |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | For DRG culture |
| Recombinant rat b-NGF | R&D Systems | 556-NG | For DRG culture |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | For DRG culture |
| 5'-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma | F0503-100MG | For DRG culture |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | For DRG culture |
References
- Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
- Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer’s disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
- Binks, B. P. . Modern characterization methods of surfactant systems. , (1999).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).
- Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
- Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
- Garvalov, B. K., et al. Luminal particles within cellular microtubules. J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).
- Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
- Gu, J., Bourne, P. E. . Structural bioinformatics. , (2009).
- De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (1998).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
- Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
- Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
- Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson’s disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
- Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
- Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
- Medalia, O., et al. Organization of actin networks in intact filopodia. Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).
- Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).
- Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
- Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
- Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
- Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
- Squire, L. R. . Fundamental neuroscience. , (2003).
- Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
- Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. 신경과학. 108, 493-506 (2001).
