이 문서는 포르말린 고정 신장 섹션의 마이크로 RNA 발현 colormetric 검출에 최적화의 현장 하이브리드 프로토콜을 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
이 문서에서 우리는 마이크로 RNA 프로브를 태그 제닌과 현장 하이브리드 화에를 통해 신장의 miRNA의 비색 검출하는 방법을 설명합니다. 원래 Kloosterman 및 Exiqon miRNA의 프로브 1 폭 넓은 사용을 위해 동료에 의해 개발 된이 프로토콜은, 신장 조직에서의 miRNA 분석에 내재 된 문제를 극복하도록 수정되었습니다. 여기에는 구조 식별 및 잔류 조사 및 항체를 제거하기 어려운 문제가 있습니다. 비교적 얇은 사용, 두께 5mm, 강한 프로브 신호가 세포 내에 유지하면서, 신장 구조의 명확한 시각화를 허용 조직 섹션. 또한, 프로브 농도와 배양 조건은 낮은 배경 및 비특이적 신호 마이크로 RNA 발현의 시각화를 용이하게하기 위해 최적화되었다. 여기서, 최적화 프로토콜은 프로 시저의 끝에서 슬라이드 실장 통해 초기 티슈 콜렉션 및 준비를 덮고, 설명한다. 기본 compone이 프로토콜의 국세청은 다른 조직과 세포 배양 모델 응용 프로그램에 대해 변경 될 수 있습니다.
서론
마이크로 RNA는 내생 적으로 생산되는 RNA를 비 암호화 (약 22 뉴클레오티드) 작은 수 있습니다. 그들은 일반적으로 번역 억압 또는 mRNA의 분해를 통해 단백질 발현을 억제하는 기능을한다. 완전 보완와 mRNA의 대상에있는 miRNA 바인딩, 그것이 가능한 하나의 miRNA가 여러 대상을 억제하기 위해 만드는.
세포의 종류와 구조의 miRNAs을 표현 이해 메커니즘을 이해의 중요한 부분 인을 통해 miRNA의 발현에 영향을 미치는 세포와 조직의 표현형의 변화. 이러한 miRNA의 시퀀싱, qPCR에 노던 블로 팅 등의 방법은 전체 조직에서의 miRNA의 검출에 사용 할 수 있지만,이 방법은 하나가 특정 조직 내에서 온 어떤 특정 세포 유형을 결정하는 것을 허용하지 않습니다. 이러한 방법을 사용하여 분석 전에 셀룰러 및 구조 구성 요소의 해부는 매우 어려울 수 있습니다 적절한 아이솔레이션을 달성하기 위해 필요한 조건은 알을 초래할 수 있습니다유전자 발현 또는 RNA를 저하에 terations. 원위치 혼성화에서 마이크로 RNA는 조직에서 마이크로 RNA 위치 및 발현 수준을 가시화하기 위해 사용하는 방법이다. 이 기술은 신장 등 이종 구조, 구성 조직에 특히 유용합니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 신장 조직 섹션
- 포르말린 - 고정 (10 %) 파라핀 신장 섹션 슬라이드 분석 전에 몇 달 동안 저장 될 수 마이크로 미터 HM (355)를 사용하여 S. 5mm 두께로 현미경 슬라이드 상으로 절단된다.
2. 솔루션 준비
- 고압 증기 멸균 나사 정상 병에 DDH 2 O에 1X PBS의 1 L를 준비합니다. DDH 2 O 1 L로 다른 병 채우기 각 병, 덮개에 DEPC의 1 ML을 추가하고 격렬하게 흔들어. 솔루션 RNAses을 파괴 한 후 오토 클레이브 실온에서 밤새 앉아 보자. PBS-T 만들기 위해 400 ㎖의 트윈 20 1X PBS의 L 1에 추가합니다.
- 단백질 분해 효소 K 버퍼 (50 mMTris 염산, pH를 8.0 DEPC에 1 ㎜ 염화칼슘 처리 된 물)을 준비합니다.
- PBS-T에서 0.2 % 글리신의 솔루션을 준비합니다.
3. 조직 준비
- 혼성화 완충액 대량 50 % 포름 아미드로 이루어진 (50 ~ 100 ㎖), 5X SSC, 0.1 % 트윈, 9.2 준비pH가 6, 50 ㎍ / ㎖의 헤파린, 및....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
혼성화, 배양 중에 건조 또는 NBT / BCIP를 개발하는 동안 더 어둡게 염색 결국 전체적으로 같이 세척 될 조직 절편의 영역. 1 HybriSlip가 가장자리 떨어져 미끄러 된 신장 부분의 일부를 보여준다 그것은 부분적으로 탈수가 될 수 있도록 조직. 나머지 단계에서 재수 커버리지에도 불구하고, 탈수 부에서의 신호는 인위적으로 높다.
NBT-BCIP 개발 시간을 제어의 중요성은도 2a 및도 2b에 설명되어있다. 신장 (그림 2A)를 통해 스크램블 - 미르 제어 탐색 할 조직의 발음 비특이적 발색에 4 ~ 5 시간의 결과보다 긴 개발 기간. 예 U6 작은 핵 RNA 제어와 같은 높은 풍부 대상, 조사해서 신장, (4-5 시간 이상 더 이상 배양 개선 신호가 발생하지 않는도 우레 2B).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 문서의 목적은 포르말린 고정 신장 조직에서 잘 작동 현장 하이브리드 화에 miRNA를위한 프로토콜을 설명했다. 이 프로토콜을 작업하는 동안 염색 유물의 몇 가지 중요한 소스가 확인되었습니다. 이러한 점에주의는 염색 유물을 방지하고 성공적인 ISH 실행의 가능성을 높일 수 있습니다.
가 조직 섹션 긴 배양 중에 건조 할 때 염색 유물의 가장 예방 가능한 원인 중 하나가 발생할 수 있습니다. 이 경우 건조되어 조직의 부분은 NBT / BCIP 개발 (그림 1) 동안 매우 어둡게 얼룩 것입니다. 이 프로토콜을 통하여 그 조직 절편이 완전히 모든 배양을 통해와 슬라이드가 완전히 수준 유지되는 액체에 의해 보호 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 또한, 조직 절편은 완전히 같은 혼성화 단계만큼 배양 중에 HybriSlips 의해 덮여 및 유지되어야 액체 손실을 방지하기 위해 항체 배양. 조직 절편의 부분 또는 완전 건조가 관찰.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
공개 아무것도 없다.
감사의 글
이 작품은 건강의 미국 국립 연구소에 의해 지원되었다 HL082798 및 HL111580을 부여합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 파라포름알데히드 | 시그마 | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| 디에틸 피로카보네이 | 시그마 | D5758 | |
| 트윈-20 | 시그마 | P1379 | |
| 자일렌 | 시그마 | 534056 | |
| 에탄올 | 울트라 퓨어 | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | 수명 Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Citric Acid | Sigma | C2404 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| 효모 RNA | 라이프 테크놀로지 | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| 프로테라제 K | 발효 | EO0491 | |
| 3' DIG- miRNA 프로브 | Exiqon | miR dependent-05 | |
| 3' DIG- 스크램블 miR 프로브 | Exiqon | 99004-05 | |
| 3' DIG- U6 miR 프로브 | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Coverslips | Fisher | Fit to tissue size | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| 인슬라이드 아웃 하이브리드화 오븐 | Boekel | 241000 | |
| 알루미늄 트레이 어셈블리 | Boekel | C2403973 | |
| 스테인레스 스틸 랙 인서트 | Boekel | C2403754 |
참고문헌
- Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney. Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).
- Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
