Чувствительностью и специфичностью Количественный метод определения Сыворотка Сердечная Миозина связывающий белок-C по электрохемилюминесценцию иммуноферментного
Summary
Измерения биомаркеров в сложных биологических образцов все больше руководящих принятия клинических решений. Мы описываем высокочувствительным методом для одновременного измерения сердечного миозин-связывающего белка С, креатин киназы MB и сердечного тропонина I в образцах сыворотки пациентов с инфарктом миокарда и группой контроля.
Abstract
Биомаркеров становится все более важным в принятии клинических решений, а также фундаментальной науки. Диагностика инфаркта миокарда (ИМ) во многом основывается на выявлении сердечно-специфических белков в пациентов сыворотки или плазмы в качестве индикатора повреждения миокарда. Недавно показано, что сердечный миозин-связывающего белка-С (cMyBP-C) можно обнаружить в сыворотке крови после ИМ, мы предложили его в качестве потенциальных биомаркеров ИМ. Биологические маркеры обычно обнаруживаются традиционными сэндвич иммуноферментного анализа. Однако этот метод требует большого объема пробы, имеет небольшой динамический диапазон, и может измерять только один белок одновременно.
Здесь мы показываем, мультиплексе иммунотестом, в котором три сердечных белки могут быть измерены одновременно с высокой чувствительностью. Измерение cMyBP-C в Uniplex или вместе с креатина киназы MB и сердечного тропонина я показал чувствительность сопоставима. Эта техника использует мезо Масштаб Discovery(MSD) способ мультиплексирования в 96-луночный планшет в сочетании с электрохемилюминесценция для обнаружения. В то время как лишь небольшие объемы образцов требуются высокая чувствительность и широкий динамический диапазон будут достигнуты. Используя эту технику, мы измерили cMyBP-C, креатин киназы MB и сердечного тропонина I в сыворотке крови образцы из 16 пациентов с ИМ и сравнили результаты с 16 субъектами управления. Мы смогли обнаружить все три маркера в этих образцах и нашел всех трех биомаркеров быть увеличена после ИМ. Этот способ, следовательно, подходит для чувствительного обнаружения сердечных биомаркеров в образцах сыворотки.
Introduction
Измерение небольших количеств белка в сложных биологических образцов, таких как сыворотка, приобретает все большее клиническое значение для лечения пациента, а также основные науки. Например, увеличение сывороточных уровней сердечных биомаркеров, таких как тропонин I, в клинических условиях согласуется с острым инфарктом миокарда (ИМ) 1. Для обнаружения белков в образцах сыворотки, стандартный твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) является наиболее часто используемым способом, как это имеет высокую чувствительность и позволяет абсолютного количественного определения анализируемого вещества. Однако традиционные ELISA, требуют относительно большого количества образца (как правило, 100 мкл), имеют высокую фонового сигнала в некоторых биологических жидкостей, а ограничиваются измерением только одного аналита в ELISA-2.
В последнее время новый метод иммуноанализа была введена в обход многие из этих недостатков. Этот модифицированный анализа, разработанного MSD, использует electrochemiluminescENCE (ECL) для обнаружения сигнала, которая позволяет очень низкий фон и повышенная чувствительность, что позволяет использовать небольшие объемы образца. Электрохемилюминесценция основан на молекуле-репортеру рутений (II) trisbipyridal, которая крепится на обнаружение антител. Это репортерной молекулой излучает свет при 620 нм на электрической стимуляцией в нижней части 96-луночный планшет который имеет углеродные электроды интегрированы в них 3. Кроме того, при использовании точечного покрытия, несколько антител захвата могут быть покрыты в одну лунку (до 10 на 96-луночном планшете), что обеспечивает одновременное определение количества различных белков в одном образце 4. Этот метод был недавно использован для измерения профилей провоспалительных цитокинов в сыворотке 5,6. Мультиплекс плиты из MSD выгодно отличаются от других платформ множественного аналитического 7.
Использование MSD в качестве основной платформы анализа, мы также разработали на заказ 3-комплекса, что с пластинойодновременного количественного определения уровня сердечного миозин-связывающего белка-C (cMyBP-C), креатин-киназы MB (CK-MB), и сердечный тропонин I (cTnI), и результаты сравнивали с monoplex обнаружения cMyBP-C. CK-MB и cTnI хорошо отлаженных биомаркеров для ИМ. Однако увеличение этих маркеров может быть вызвано патологий, кроме М.И., например, миокардит или почечной недостаточностью 8. Это свидетельствует о добавлении дополнительных биомаркеров для увеличения специфичности диагностики инфаркта миокарда. Недавно мы показали, что cMyBP-C также является потенциальным биомаркеров для MI 9. cMyBP-C представляет собой толстую нить ассоциированный белок, который экспрессируется в сердце, 10-12, но не в скелетной или гладкой мускулатуры. Таким образом, повышение уровня cMyBP-C в системе кровообращения является специфическим показателем повреждения сердца 13.
В этом исследовании сравнивали Uniplex обнаружения cMyBP-C с использованием пользовательского 3-комплекса анализе на определение сывороточных уровнейcMyBP-C, CK-MB, и cTnI в сыворотке крови больных с ОИМ. В будущем эта подпись техники может быть использован для диагностики инфаркта миокарда у пациентов с болями в груди в отделении неотложной помощи.
Учреждение обзор платы (IRB) из Университета Лойолы Чикаго одобрил исследования для использования deidentified человека образцы и использование иммуноферментного анализа (LU # 20392).
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании мы покажем применимость мультиплекса иммуноанализа для обнаружения нескольких сердечных биомаркеров в сыворотке крови у пациентов. Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными ELISA. Во-первых, в ECL набора для анализа используют вместо колориметрич?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось Национальным институтом здоровья и гранты R01HL105826 K02HL114749 (Dr. Sadayappan) и Американской Ассоциации Сердца Запада стипендий; 11PRE7240022 (г-н Barefield) и 13POST14720024 (Dr. Говиндана). Авторы выражают признательность за помощь доктор Джимми Пейдж, Джилл Clampit и д-р Джон Хадсон, MSD, за их отличную техническую поддержку и литературы в развитии анализа.
Materials
| Reagents | |||
| MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant | Meso Scale Discovery | R92TC-2 | |
| Tween-20 | Acros | 9005-64-5 | |
| MSD Blocker A | Meso Scale Discovery | R93BA-1 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher BioReagents | BP399-4 | Filter before use |
| Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free | Santa Cruz | SC-137180L | For coating, antibody has to be gelatin free |
| Plates and Equipment | |||
| Multi-Array 96-well standard plate | Meso Scale Discovery | L15XA-3 | |
| A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB | Meso Scale Discovery | N452A-1 | |
| ThermaSeal Sealing Film | Life Science Products Inc. | ST-3098 | |
| MSD SECTOR Imager 2400A | Meso Scale Discovery | ||
| MTS 2/4 digital microtiter shaker | IKA | 3208001 |
References
- Thygesen, K., et al. Third universal definition of myocardial infarction. Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).
- Leng, S. X., et al. ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).
- Thompson, I., et al. Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains. Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).
- Kingsmore, S. F. Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays. Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).
- Altan, Z. M., et al. A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis. J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466 (2010).
- Patel, K. D., et al. High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction. Clin. Immunol. 133, 251-256 (2009).
- Fu, Q., Zhu, J., Van Eyk, J. E. Comparison of multiplex immunoassay platforms. Clin. Chem. 56, 314-318 (2010).
- Mahajan, V. S., Jarolim, P. How to interpret elevated cardiac troponin levels. Circulation. 124, 2350-2354 (2011).
- Govindan, S., et al. Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164 (2012).
- Barefield, D., Sadayappan, S. Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease. J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875 (2010).
- Kuster, D. W., et al. Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease. J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52 (2012).
- Sadayappan, S., de Tombe, P. P. Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function. Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).
- Sadayappan, S. Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury. Biomark Med. 6, 69-72 (2012).
- Fichorova, R. N., et al. Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study. Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).
- Malekzadeh, A., et al. Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases. Methods. 56, 508-513 (2012).
