Dyrkning og vedligeholdelse<em> Clostridium difficile</em> I et anaerobt miljø
Summary
Clostridium difficile er en patogen bakterie, der er en streng anaerob og forårsager antibiotika associeret diarré (AAD). Her, fremgangsmåder til isolering, dyrkning og vedligeholdelse C. difficile vegetative celler og sporer er beskrevet. Disse teknikker kræver en anaerob kammer, der kræver regelmæssig vedligeholdelse for at sikre ordentlige forhold for optimal C. difficile dyrkning.
Abstract
Clostridium difficile er en Gram-positiv, anaerob, sporogenic bakterie, der er hovedansvarlig for antibiotika associeret diaré (AAD) og er en betydelig nosokomiel patogen. C. difficile er notorisk vanskeligt at isolere og dyrke og er yderst følsom over for selv lave niveauer af ilt i miljøet. Her metoder til isolering C. difficile fra fækale prøver og efterfølgende dyrkning af C. difficile til forberedelse af glycerolstamopløsninger til langtidsopbevaring præsenteres. Teknikker til at forberede og optælle Spore lagre i laboratoriet til en række downstream-applikationer, herunder mikroskopi og dyreforsøg er også beskrevet. Disse teknikker kræver en anaerob kammer, som opretholder en konsekvent anaerobt miljø for at sikre ordentlige forhold for optimal C. difficile vækst. Vi giver protokoller til overførsel af materialer ind og ud af kammeret uden CAhjælp betydelig forurening ilt sammen med forslag til regelmæssig vedligeholdelse kræves for at opretholde den rette anaerobt miljø for effektiv og konsekvent C. difficile dyrkning.
Introduction
Clostridium difficile er en Gram-positiv, sporedannende bakterie, der er en obligat anaerob og en potentielt fatal gastrointestinal patogen for mennesker og dyr. Oprindeligt beskrevet i 1935 som en kommensal organisme findes i fækale prøver fra nyfødte 1 C. difficile blev senere påvist at være det agens af pseudomembranøs colitis forbundet med antibiotisk behandling 2. C. difficile infektioner (CDI) er kendetegnet typisk ved antibiotisk behandling, der resulterer i forstyrrelse af normale colonflora, at skabe en niche for C. difficile at trives 2. C. difficile sendes som en hvilende spore via fækal-orale vej og derefter spirer i mave-tarmkanalen, der producerer vegetative celler i stand til at generere flere toksiner og forårsage alvorlig sygdom og colitis 3. CDI er ofte resistente over for konventionelle behandlinger, og disse iinfektioner er ofte gentaget 4. Som et resultat, CDI er ansvarlige for op til 4,8 milliarder dollar i udgifterne til sundhedsvæsenet i USA 5-7.
C. difficile er meget følsomt over for selv lave niveauer af oxygen i miljøet. For C. difficile at forblive i miljøet og effektivt overføres fra vært til vært, dannelsen af en metabolisk inaktive spore er kritisk 8. Fordi laboratoriet vedligeholdelse og manipulation af C. difficile kræver en kontrolleret anaerobt miljø, disse teknikker kræver anvendelse af et anaerobt kammer. Brug af anaerobe kamre har resulteret i øget nyttiggørelse og isolering af obligate anaerober 9-11, og har givet en række molekylære teknikker, der skal udføres i en anaerob atmosfære.
Ud over C. difficile, den anaerobe kammer brug og vedligeholdelse beskrevet her gældertil andre obligate anaerobe såsom andre Clostridium arter (f.eks C. perfringens), andre gastrointestinale arter (f.eks Bacteroides arter 12) og parodontale patogener (f.eks Peptostreptococcus arter 13).
Protocol
Representative Results
Discussion
De her beskrevne metoder giver mulighed for enkel og hurtig genopretning af C. difficile fra en række fækale prøver, herunder mennesker, mus og hamstere, samt langtidsopbevaring C. difficile glycerol eller spore bestande. C. difficile kan være en vanskelig organisme at dyrke, men omhyggelig vedligeholdelse af et anaerobt miljø og anvendelse af aseptiske teknikker kan give for robust vækst og en reduktion i forurening.
Anaerobe kamre: Overvejelser og vedligeholde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Coy Laboratories for venligt at levere billeder af den anaerobe kammer. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health tilskud DK087763 (SMM) og en STEP / HHMI Curriculum Development Fellowship (ANE).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Proteose Peptone no. 2 | BD | 212120 | |
| Na2HPO4 | Fisher | S373 | |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| MgSO4 (anhydrous) | Fisher | M65 | |
| ᴅ-Fructose | Fisher | L96 | |
| Sodium taurocholate | Sigma | T4009 | |
| ᴅ-cycloserine | Sigma | C6880 | |
| Cefoxitin | Fluka | C4786 | |
| Brain heart infusion medium | BD | 237300 | |
| Proteose Peptone | BD | 211684 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A5132 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| L-cysteine | Sigma | C7755 | |
| BactoPeptone | BD | 211684 | |
| Columbian sheep blood agar | Fisher | L21928 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| KCl | Fisher | P217 | |
| Glycerol | Fisher | BP2291 | |
| Sterile inoculating loops | Fisher | 22363596 | |
| Sterile swabs | Fisher | 1495990 | |
| Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories | Coy Laboratory Products, Inc | Customer Specified | These items are custom ordered per laboratory needs |
| Materials | |||
| TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydrous) 0.1 g Fructose 6 g Agar 20 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add: 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 25 ml of 10 mg/ml ᴅ-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml) 1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml) BHIS Medium Brain heart infusion 37 g Yeast extract 5 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Protease peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1.5 g Agar 15 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Protease peptone 3.5 g Brain heart infusion 11.1 g Yeast extract 1.5 g (NH4)2SO4 0.7 g Tris base 1.06 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). Blood agar The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 1X Phosphate buffered saline (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use. |
References
- Hall, I. C., O’Toole, E. Intestinal flora in new-borin infants – With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).
- Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. Clindamycin-Associated Colitis – Prospective Study. Ann. Intern. Med. 81, 429-433 (1974).
- Gerding, D. N. Clostridium difficile 30 years on: what has, or has not, changed and why. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 2-8 (2009).
- Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C. Treatment of Clostridium difficile infection. Clin. Infect. Dis. 46, 32-42 (2008).
- Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin. Infect. Dis. 55, 88-92 (2012).
- Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin. Microbiol. Infect. 18, 5-12 (2012).
- Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143, 1171-1173 (2012).
- Deakin, L. J., et al. The Clostridium difficile spo0A gene is a persistence and transmission factor. Infect. Immun. 80, 2704-2711 (2012).
- Drasar, B. S. Cultivation of anaerobic intestinal bacteria. J. Pathol. Bacteriol. 94, 417-427 (1967).
- Leach, P. A., Bullen, J. J., Grant, I. D. Anaerobic CO 2 cabinet for the cultivation of strict anerobes. Appl. Microbiol. 22, 824-827 (1971).
- Killgore, G. E., Starr, S. E., Del Bene, ., Whaley, V. E., N, D., Dowell, V. R. Comparison of three anaerobic systems for the isolation of anaerobic bacteria from clinical specimens. Am. J. Clin. Pathol. 59, 552-559 (1973).
- Bacic, M. K., Smith, C. J. Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 13, Unit 13C 11 (2008).
- Doan, N., Contreras, A., Flynn, J., Morrison, J., Slots, J. Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria. J. Clin. Microbiol. 37, 171-174 (1999).
- Socransky, S., Macdonald, J. B., Sawyer, S. The cultivation of Treponema microdentium as surface colonies. Arch. Oral. Biol. 1, 171-172 (1959).
- George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 9, 214-219 (1979).
- Wilson, K. H., Silva, J., Fekety, F. R. Suppression of Clostridium difficile by normal hamster cecal flora and prevention of antibiotic-associated cecitis. Infect. Immun. 34, 626-628 (1981).
- Wilson, K. H., Kennedy, M. J., Fekety, F. R. Use of sodium taurocholate to enhance spore recovery on a medium selective for Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 15, 443-446 (1982).
- Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).
- Marler, L. M., et al. Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools. J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).
- Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1 (2009).
- Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. Genetic manipulation of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2 (2011).
- Lemee, L., Pons, J. L. Multilocus sequence typing for Clostridium difficile. Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).
- Shanholtzer, C. J., Peterson, L. R., Olson, M. N., Gerding, D. N. Prospective study of gram-stained stool smears in diagnosis of Clostridium difficile colitis. J. Clin. Microbiol. 17, 906-908 (1983).
- Smith, C. J., Markowitz, S. M., Macrina, F. L. Transferable tetracycline resistance in Clostridium difficile. Antimicrob. Agents Chemother. 19, 997-1003 (1981).
- Permpoonpattana, P., et al. Surface layers of Clostridium difficile endospores. J. Bacteriol. 193, 6461-6470 (2011).
- Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins. J. Bacteriol. , (2013).
- Burns, D. A., Minton, N. P. Sporulation studies in Clostridium difficile. J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).
- Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).
- Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid. J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).
- O’Connor, J. R., et al. Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants. Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).
- Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface. J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).
- Koch, C. J., Kruuv, J. The release of oxygen from polystyrene Petri dishes. Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).
- Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J. Bacteriol. , (2012).
- Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. Anaerobic cell culture. Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F (2009).
- Lyras, D., et al. Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature. 458, 1176-1179 (2009).
