클로 스트 리듐 디피는 엄격한 혐기성 미생물과 항생제 관련 설사 (AAD)를 일으키는 원인이되는 병원성 세균입니다. 여기서, 분리 배양 및 C를 유지하기위한 방법 어울리지 않는 식물 세포 및 포자가 설명되어 있습니다. 이 기술은 최적의 C에 대한 적절한 조건을 보장하기 위해 정기적 인 유지 보수를 필요로하는 혐기성 챔버를 필요로 남과 어울리지 재배.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
클로 스트 리듐 디피 항생제 관련 설사 (AAD)의 주된 책임이며 중요한 병원 내 병원체 그람 양성, 혐기성, sporogenic 세균이다. C. 남과 어울리지 분리 및 배양하는 악명 어려운 환경에있는 산소도 낮은 수준에 매우 민감하다. 여기에, C.를 분리하는 방법 대변 샘플에서 어울리지 이후에 배양 C. 장기 저장을위한 글리세롤 주식의 준비를위한 어울리지이되게됩니다. 현미경과 동물 연구 등의 다운 스트림 응용 프로그램의 다양한 실험실에서 포자 주식을 준비하고 열거하는 기술도 설명되어 있습니다. 이 기술은 최적의 C에 대한 적절한 조건을 보장하기 위해 일관성있는 혐기성 환경을 유지하는 혐기성 챔버를 필요로 남과 어울리지 성장. 우리는 CA없이 챔버 안팎으로 물질을 전달하기위한 프로토콜을 제공한다효율적이고 일관성있는 C.에 해당하는 혐기성 환경을 유지하기 위해 필요한 정기적 인 유지 보수에 대한 제안과 함께 중요한 산소 오염을 사용하여 남과 어울리지 재배.
서론
클로 스트 리듐 디피는 의무를 혐기성 미생물과 인간과 동물의 잠재적으로 치명적인 위장 병원체 그람 양성, 포자를 형성하는 박테리아입니다. 처음에는 신생아 1, C.에서 배설물 샘플에서 발견 공생 생물로 1935 년에 설명 어울리지는 나중에 항생제 치료 2와 관련된 위 막성 대장염의 원인 물질로 증명되었다. C.에게 남과 어울리지 않는 감염 (CDI)는 일반적으로 C에 대한 틈새 시장을 창조하는 정상 결장 식물의 중단 결과 항생제 치료가옵니다 어울리지 2 번창한다. C. 어울리지는 분변 - 경구 경로를 통해 휴면 포자로 전송 이후에 여러 가지 독소를 생성하고 심각한 질병 및 대장염 3을 일으킬 수있는 식물 세포를 생산, 위장 내에서 발아한다. CDI는 종종 기존의 치료와 이들의에 불응fections 자주 4를 반복합니다. 그 결과, CDI는 미국 5-7 의료 비용의 최대 48억달러에 대한 책임이 있습니다.
C. 남과 어울리지 않는 환경에있는 산소도 낮은 수준에 매우 민감하다. C.에....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
참고 : C. 어울리지 위장 질환을 일으킬 수있는 인간과 동물의 병원체이다. C. 관련된 실험 어울리지 적절한 바이오 안전성주의 사항 (BSL-2)으로 수행해야합니다.
1. 혐기성 실 사용 및 유지 보수
C. 남과 어울리지 않는 엄격한 혐기성 미생물과 대기 중의 산소도 낮은 농도에 매우 민감하다. 따라서, 제어, 혐기성 환경은 성공적인 조작에 필요하다. 혐기성 챔버 (도 1a)의 사용은 C. 효과적인 재배 가장 안정적인 환경과 이상적인 조건을 제공한다 남과 다른 혐기성 세균 14. 여기서, 혼합 가스 (5 % CO 2, 10 % H 2, 85 % N 2)를 함유하는 분위기가 안정적으로 유지 될 수있다.
중요한 산소 오염없이 실에 어떤 항목을 소개하고,에어 록 (그림 1B)를 사용해야합니다. 이 장치의 가스 교환 등의 기능과는 반 수동으로 또는 수동으로, 자동으로 작동합니다. 에어 록의 외부와 혐기성 챔버의 내....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
C.의 예 BHIS 컬럼비아 혐기성 양의 혈액 한천 매체에 성장 어울리지는 그림 2에서 볼 수 있습니다. C. 어울리지는 평면이며 모두 미디어에 분명하다 지상 유리 외관을 가지고 불규칙한 식민지를 형성한다. 여기에, C.의 에리스로 마이신에 민감한 임상 분리 남과 어울리지 않는, 630E (30)는 37 ° C (그림 2A)에서 24 시간 동안, BHIS 한천, 농축, 비 선택 배지에서 재배된다. 컬럼비아 혐기성 양의 혈액 한천에 식민지 흰색 빛 (그림 2B)에서 BHIS에 성장 것과 유사하게 나타납니다하지만,이 매체의 사용은 C.에 의해 전시 된 녹색 또는 연두색 형광 검출을 제공한다 남과 어울리지 장파 자외선에서 (UV) 빛 (15) (그림 2C).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
여기에서 설명하는 방법은 C의 간단하고 신속하게 복구 할 수 인간, 마우스, 햄스터, C. 등의 장기 저장을 포함한 분변 시료의 다양한에서 디피 글리세롤 또는 포자 주식으로 어울리지. C. 어울리지 경작하기 어려운 유기체가 될 수 있지만주의 혐기성 환경의 유지 보수 및 무균 기술의 응용 프로그램은 강력한 성장과 오염의 감소를 제공 할 수 있습니다.
혐기성 챔버 : 고려 사항 및 유지 보수
단단한 챔버 또는 비닐 실 : 혐기성 챔버의 두 가지 유형이 있습니다. 초대형 챔버는 전형적 가성 화학 물질의 사용을 허용하는, 알루미늄 또는 경질 중합체 (예 : 플렉시 유리 또는 아크릴 재질)로 만든다. 엄밀한 챔버 gloveless 스타일로 변환 자국에 덜 경향이 될 수 있지만, 누수 감지하고 발견하기 어렵고 딱딱한 챔버는 몇 가지 방법이 필요사용중 가스 변위를.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 친절하게 혐기성 챔버의 사진을 제공 수줍어 연구소에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 건강 보조금 DK087763 (SMM) 및 STEP / HHMI 교육 과정 개발 원정대 (ANE)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
TCCFA 한천 < / strong>
프로테오스 펩톤 no. 2 (Difco) 40 g < / > Na 2 < / sub>HPO 4< / sub> 5 g < br / > KH 2 < / sub >PO 4< / sub> 1 g
NaCl 2 g < br / > MgSO 4< / sub >(무수) 0.1 g < / > 과당 6 g
한천 20 g
< > 121 °deg에서 탈 이온수 및 오토 클레이브와 함께 1L로 가져옵니다. C 20 분 살균 .
< / > 오토 클레이브 후, 추가 :
10 % (w / v) 타우로 콜산 나트륨 10ml, 필터 멸균 (물에 용해, 최종 농도, 0.1 %)
10 mg / ml á'...-cycloserine, 필터 살균 (물에 용해, 최종 농도, 250 μ g/ml)
10 mg/ml 세폭시틴 1.6 ml, 여과기 살균하는 (물에 녹입니다; 마지막 농도, 16 μ g/ml)
BHIS Medium
Brain heart infusion 37 g
효모 추출물 5 g
플레이트의 경우 한천 15g을 추가합니다. 탈이온수와 함께 121°C에서 1L로 가져오고 오토클레이브를 사용합니다. C 살균 20 분 .
< br / > 옵션 (오토 클레이브 후 추가) :
< / > 10 % (w / v) L- 시스테인 3ml (물에 용해, 최종 농도, 0.03 %)
10 % (w / v) 타우로 콜산 나트륨 10ml (물에 용해, 최종 농도, 0.1 %)
SMC 포자 형성 매체 < / strong>
BactoPeptone 90 g
프로테아제 펩톤 5 g
(NH4)2SO4 1 g
Tris base 1.5 g
Agar 15 g
121°°C에서 탈이온수와 오토클레이브를 1L로 가져옵니다. C 살균 20 분 .
< br / > 옵션 (오토 클레이브 후 추가) :
10 % (w / v) L- 시스테인 3ml (물에 용해, 최종 농도, 0.03 %)
< / > < 강> 70 : 30 매체 < / 강>< > < / > 박토 펩톤 63 g < > 프로테아제 펩톤 3.5 g < / > 뇌 심장 주입 11.1 g < > 효모 추출물 1.5g
(NH4)2SO4 0.7g
트리스 베이스 1.06g
플레이트의 경우 15g 한천을 추가합니다. 탈이온수와 함께 121°C에서 1L로 가져오고 오토클레이브를 사용합니다. C를 20분 동안 살균합니다. 오토클레이브 후 10%(w/v) L-시스테인(최종 농도, 0.03%).
Blood agar
3ml를 추가합니다.미리 만들어진 Columbia 혐기성 양 혈액 한천 플레이트(Fisher Scientific, L21928)35를 사용하는 것이 좋습니다.
1X 인산염 완충 식염수(PBS)
NaCl 8.01 g
KCl 0.2 g
Na2HPO4 1.44 g
KH2PO4 0.27 g
탈이온수로 1L로 가져오고 HCl로 pH를 7.4로 조정합니다. 사용하기 전에 살균하십시오.
따라 맞춤 주문됩니다 < colspan = "4 ">
프로테오스 펩톤 no. 2 (Difco) 40 g < / > Na 2 < / sub>HPO 4< / sub> 5 g < br / > KH 2 < / sub >PO 4< / sub> 1 g
NaCl 2 g < br / > MgSO 4< / sub >(무수) 0.1 g < / > 과당 6 g
한천 20 g
< > 121 °deg에서 탈 이온수 및 오토 클레이브와 함께 1L로 가져옵니다. C 20 분 살균 .
< / > 오토 클레이브 후, 추가 :
10 % (w / v) 타우로 콜산 나트륨 10ml, 필터 멸균 (물에 용해, 최종 농도, 0.1 %)
10 mg / ml á'...-cycloserine, 필터 살균 (물에 용해, 최종 농도, 250 μ g/ml)
10 mg/ml 세폭시틴 1.6 ml, 여과기 살균하는 (물에 녹입니다; 마지막 농도, 16 μ g/ml)
BHIS Medium
Brain heart infusion 37 g
효모 추출물 5 g
플레이트의 경우 한천 15g을 추가합니다. 탈이온수와 함께 121°C에서 1L로 가져오고 오토클레이브를 사용합니다. C 살균 20 분 .
< br / > 옵션 (오토 클레이브 후 추가) :
< / > 10 % (w / v) L- 시스테인 3ml (물에 용해, 최종 농도, 0.03 %)
10 % (w / v) 타우로 콜산 나트륨 10ml (물에 용해, 최종 농도, 0.1 %)
SMC 포자 형성 매체 < / strong>
BactoPeptone 90 g
프로테아제 펩톤 5 g
(NH4)2SO4 1 g
Tris base 1.5 g
Agar 15 g
121°°C에서 탈이온수와 오토클레이브를 1L로 가져옵니다. C 살균 20 분 .
< br / > 옵션 (오토 클레이브 후 추가) :
10 % (w / v) L- 시스테인 3ml (물에 용해, 최종 농도, 0.03 %)
< / > < 강> 70 : 30 매체 < / 강>< > < / > 박토 펩톤 63 g < > 프로테아제 펩톤 3.5 g < / > 뇌 심장 주입 11.1 g < > 효모 추출물 1.5g
(NH4)2SO4 0.7g
트리스 베이스 1.06g
플레이트의 경우 15g 한천을 추가합니다. 탈이온수와 함께 121°C에서 1L로 가져오고 오토클레이브를 사용합니다. C를 20분 동안 살균합니다. 오토클레이브 후 10%(w/v) L-시스테인(최종 농도, 0.03%).
Blood agar
3ml를 추가합니다.미리 만들어진 Columbia 혐기성 양 혈액 한천 플레이트(Fisher Scientific, L21928)35를 사용하는 것이 좋습니다.
1X 인산염 완충 식염수(PBS)
NaCl 8.01 g
KCl 0.2 g
Na2HPO4 1.44 g
KH2PO4 0.27 g
탈이온수로 1L로 가져오고 HCl로 pH를 7.4로 조정합니다. 사용하기 전에 살균하십시오.
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 프로테오스 펩톤 번호 2 | BD | 212120 | |
| Na2HPO4 | Fisher | S373 | |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| MgSO4 (무수) | Fisher | M65 | |
| Fructose | Fisher | L96 | |
| Sodium taurocholate | Sigma | T4009 | |
| á'...-cycloserine | Sigma | C6880 | |
| Cefoxitin | Fluka | C4786 | |
| Brain heart infusion medium | BD | 237300 | |
| Proteose Peptone | BD | 211684 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A5132 | |
| 트리스 베이스 | 피셔 | BP152 | |
| 한천 | BD | 214010 | |
| L-시스테인 | 시그마 | C7755 | |
| 박토펩톤 | BD | 211684 | |
| 콜롬비아 양 혈액 한천 | 피셔 | L21928 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| KCl | Fisher | P217 | |
| 글리세롤 | Fisher | BP2291 | |
| 멸균 접종 루프 | Fisher | 22363596 | |
| 멸균 면봉 | Fisher | 1495990 | |
| Coy 비닐 혐기성 챔버 및 액세서리 | Coy Laboratory Products, Inc | 고객 지정 | 이 품목은 실험실의 필요에 |
| Materials< / strong> | |||
참고문헌
- Hall, I. C., O'Toole, E. Intestinal flora in new-borin infants - With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).
- Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. Clindamycin-Associated Coliti....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
