Dyrking og Vedlikehold<em> Clostridium difficile</em> I et anaerobt miljø

Summary

Clostridium difficile er en sykdomsfremkallende bakterie som er en streng anaerob og forårsaker antibiotikaassosiert diaré (AAD). Her, fremgangsmåter for isolering, dyrking og opprettholdelse C. difficile vegetative celler og sporer, er beskrevet. Disse teknikkene nødvendig en anaerob kammer, som krever regelmessig vedlikehold for å sikre ryddige forhold for optimal C. difficile dyrking.

Abstract

Clostridium difficile er en Gram-positive, anaerob, sporogenic bakterie som er hovedansvarlig for antibiotikaassosiert diaré (AAD), og er en betydelig nosokomial patogen. C. difficile er notorisk vanskelig å isolere og dyrke og er ekstremt følsomme overfor til og med lave nivåer av oksygen i miljøet. Her, fremgangsmåter for å isolere C. difficile fra fecal prøver og senere dyrking C. difficile for utarbeidelse av glyserol aksjer for langtidslagring presenteres. Teknikker for å forberede og opplisting spore aksjer i laboratoriet for en rekke nedstrøms applikasjoner, inkludert mikroskopi og dyrestudier er også beskrevet. Disse teknikkene gjør det nødvendig et anaerobt kammer, som opprettholder en jevn anaerobt miljø for å sikre riktig forhold for optimal C. difficile vekst. Vi gir protokoller for overføring av materialer inn og ut av kammeret uten at cabruker betydelig oksygen forurensning sammen med forslag til regelmessig vedlikehold er nødvendig for å opprettholde riktig anaerobt miljø for effektiv og konsekvent C. difficile dyrking.

Introduction

Clostridium difficile er en Gram-positiv, sporedannende bakterie som er en obligat anaerob og en potensielt fatal gastrointestinal patogen for mennesker og dyr. I utgangspunktet beskrevet i 1935 som en commensal organisme som finnes i fekal prøver fra nyfødte ^1, C. difficile ble senere vist seg å være den utløsende agent for pseudomembranøs kolitt assosiert med antibiotikabehandling ^to. C. difficile infeksjoner (CDI) er vanligvis innledes med antibiotika behandling som resulterer i avbrudd av den normale colonic flora, noe som skaper en nisje for C. difficile å trives ^to. C. difficile overføres som et sovende spore via fekal-oral rute og deretter spirer i mage-tarmkanalen, som produserer vegetative celler i stand til å generere en rekke giftstoffer og forårsaker alvorlig sykdom og kolitt ^3.. CDI er ofte responderer på konvensjonelle behandlinger og disse iFections blir stadig gjentatt ^fire. Som et resultat, CDI er ansvarlig for opp til $ 4,8 milliarder kroner i helsekostnader i USA ^5-7.

C. difficile er svært følsom for og med lave nivåer av oksygen i miljøet. For C. difficile å vedvare i miljøet og bli effektivt overføres fra vert til vert, er kritisk ⁸ dannelsen av en metabolsk inaktive spore. Fordi laboratoriet vedlikehold og manipulering av C. difficile krever en kontrollert, anaerobt miljø, er disse teknikker nødvendiggjøre bruk av et anaerobt kammer. Bruk av anaerobe kammer har resultert i økt utvinning og isolering av obligate anaerober ^9-11, og har tillatt et antall molekylære teknikker som skal utføres i en anaerob atmosfære.

I tillegg til C. difficile, anaerob kammer bruk og vedlikehold som er beskrevet her er aktuelttil andre obligat anaerobe eksempel andre clostridietypene (f.eks C. perfringens), andre gastrointestinale arter (f.eks Bacteroides arter ¹²⁾ og periodontale patogener (f.eks Peptostreptococcus arter ^13).

Protocol

Merk: C. difficile er en human og animalsk patogen som kan forårsake gastrointestinal sykdom. Forsøk med C. difficile må utføres med egnede forholdsregler for biologisk sikkerhet (BSL-2). En. Anaerob Chamber Bruk og vedlikehold C. difficile er et strengt anaerobe og er ekstremt følsomme overfor selv lave konsentrasjoner av oksygen i atmosfæren. Derfor er en kontrollert, anaerobt miljø som er nødvendig for en vellykket manipulasjon…

Representative Results

Et eksempel på C. difficile dyrket på BHIS og Columbia anaerob saueblodagar materiale kan sees i figur 2. C. difficile danner uregelmessige kolonier som er flat og har en slipt glass utseende som er tydelig på begge medier. Her en erytromycin-sensitive klinisk isolat av C. difficile, 630E 30 er dyrket på BHIS agar, en beriket, ikke-selektivt medium, i 24 timer ved 37 ° C (figur 2 A). Kolonier på Columbia anaerob saueblodagar ser tilsvarende de…

Discussion

Metodene som beskrives her, gir mulighet for enkel og hurtig gjenvinning av C. difficile fra en rekke fekale prøver, inkludert mennesker, mus og hamstere, samt langtidslagring av C. difficile som glyserol eller spore aksjer. C. difficile kan være vanskelig å dyrke organismen, men nøye vedlikehold av et anaerobt miljø, og anvendelse av aseptiske teknikker, kan gi for sterk vekst og redusert forurensning.

Anaerob kamre: Hensyn og Vedlikehold

<p class="jove_cont…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Proteose Peptone no. 2	BD	212120
Na2HPO4	Fisher	S373
KH2PO4	Fisher	BP362
NaCl	Fisher	S27
MgSO4 (anhydrous)	Fisher	M65
ᴅ-Fructose	Fisher	L96
Sodium taurocholate	Sigma	T4009
ᴅ-cycloserine	Sigma	C6880
Cefoxitin	Fluka	C4786
Brain heart infusion medium	BD	237300
Proteose Peptone	BD	211684
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Tris base	Fisher	BP152
Agar	BD	214010
L-cysteine	Sigma	C7755
BactoPeptone	BD	211684
Columbian sheep blood agar	Fisher	L21928
NaCl	Fisher	S27
KCl	Fisher	P217
Glycerol	Fisher	BP2291
Sterile inoculating loops	Fisher	22363596
Sterile swabs	Fisher	1495990
Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories	Coy Laboratory Products, Inc	Customer Specified	These items are custom ordered per laboratory needs
			Materials
			TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydrous) 0.1 g Fructose 6 g Agar 20 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add: 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 25 ml of 10 mg/ml ᴅ-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml) 1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml) BHIS Medium Brain heart infusion 37 g Yeast extract 5 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Protease peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1.5 g Agar 15 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Protease peptone 3.5 g Brain heart infusion 11.1 g Yeast extract 1.5 g (NH4)2SO4 0.7 g Tris base 1.06 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). Blood agar The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 1X Phosphate buffered saline (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use.