Clostridium difficile är en patogen bakterie som är en strikt anaerob och orsakar antibiotika associerad diarré (AAD). Här, metoder för isolering, odling och underhålla C. difficile vegetativa celler och sporer beskrivs. Dessa tekniker kräver en anaerob kammare, som kräver regelbundet underhåll för att garantera lämpliga förhållanden för optimal C. difficile odling.
Clostridium difficile är en grampositiv, anaerob, sporogenic bakterie som är primärt ansvarig för antibiotikaassocierad diarré (AAD) och är en viktig nosokomial patogen. C. difficile är notoriskt svårt att isolera och odla och är extremt känslig för även låga halter av syre i miljön. Här, metoder för att isolera C. difficile från avföringsprover och därefter odling av C. difficile för beredning av glycerol lager för långtidslagring presenteras. Tekniker för att förbereda och räkna spor bestånden i laboratoriet för en mängd olika tillämpningar i senare led, inklusive mikroskopi och djurstudier beskrivs också. Dessa tekniker kräver en anaerob kammare, som upprätthåller en konsekvent anaerob miljö för att garantera lämpliga förhållanden för optimal C. difficile tillväxt. Vi tillhandahåller protokoll för överföring av material in och ut ur kammaren utan Camed hjälp av betydande förorening syre tillsammans med förslag på regelbundet underhåll som krävs för att upprätthålla en lämplig anaerob miljö för effektiv och konsekvent C. difficile odling.
Clostridium difficile är en grampositiv, sporbildande bakterie som är en obligat anaerob och en potentiellt livshotande gastrointestinal patogen för människor och djur. Inledningsvis beskrivs 1935 som kommen organism som finns i avföringsprover från nyfödda 1, C. difficile har senare visat sig vara den orsakande agent för pseudomembranös kolit i samband med antibiotikabehandling 2. C. difficile infektioner (CDI) är oftast föregås av antibiotikabehandling som resulterar i avbrott i den normala kolon floran, skapa en nisch för C. difficile att blomstra 2. C. difficile överförs som ett vilande spor via den fekala-orala vägen och därefter gror i mag-tarmkanalen och att producera vegetativa celler i stånd att alstra flera toxiner och orsakar svår sjukdom och kolit 3. CDI är ofta eldfasta till konventionell behandling och dessa iFections ofta återkommande 4. Som ett resultat, CDI ansvarar för upp till $ 4,8 miljarder sjukvårdskostnader i USA 5-7.
C. difficile är mycket känsliga för även låga nivåer av syre i miljön. För C. difficile att finnas kvar i miljön och effektivt överförs från värd till värd, är bildandet av ett metaboliskt inaktiva sporer kritisk 8. Eftersom laboratorie underhåll och manipulering av C. difficile kräver en kontrollerad, anaerob miljö, dessa tekniker kräver användning av en anaerob kammare. Användning av anaeroba kammare har lett till ökad återvinning och isolering av obligata anaerober 9-11, och har gjort ett antal molekylära tekniker som ska utföras i en anaerob miljö.
Förutom C. difficile, den anaeroba kammar användning och underhåll som beskrivs här gällertill andra obligata anaerober såsom andra klostridie arter (t.ex. C. perfringens), andra gastrointestinala arter (t.ex. Bacteroides arter 12) och parodontala patogener (t.ex. Peptostreptococcus arter 13).
De metoder som beskrivs här möjliggör enkel och snabb återhämtning av C. difficile från en mängd olika fekala prover, inklusive människor, möss och hamstrar, såväl som långtidslagring av C. difficile som glycerol eller spore bestånd. C. difficile kan vara en svår organism att odla, men noggrant underhåll av en anaerob miljö och tillämpningen av aseptisk teknik kan ge stark tillväxt och en minskning av föroreningar.
Anaeroba kammare: Överväganden o…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Coy Laboratories för vänligt ger bilder av den anaeroba kammaren. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag DK087763 (SMM) och en STEP / HHMI Curriculum Development Fellowship (ANE).
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Proteose Peptone no. 2 | BD | 212120 | |
Na2HPO4 | Fisher | S373 | |
KH2PO4 | Fisher | BP362 | |
NaCl | Fisher | S27 | |
MgSO4 (anhydrous) | Fisher | M65 | |
ᴅ-Fructose | Fisher | L96 | |
Sodium taurocholate | Sigma | T4009 | |
ᴅ-cycloserine | Sigma | C6880 | |
Cefoxitin | Fluka | C4786 | |
Brain heart infusion medium | BD | 237300 | |
Proteose Peptone | BD | 211684 | |
(NH4)2SO4 | Sigma | A5132 | |
Tris base | Fisher | BP152 | |
Agar | BD | 214010 | |
L-cysteine | Sigma | C7755 | |
BactoPeptone | BD | 211684 | |
Columbian sheep blood agar | Fisher | L21928 | |
NaCl | Fisher | S27 | |
KCl | Fisher | P217 | |
Glycerol | Fisher | BP2291 | |
Sterile inoculating loops | Fisher | 22363596 | |
Sterile swabs | Fisher | 1495990 | |
Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories | Coy Laboratory Products, Inc | Customer Specified | These items are custom ordered per laboratory needs |
Materials | |||
TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydrous) 0.1 g Fructose 6 g Agar 20 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add: 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 25 ml of 10 mg/ml ᴅ-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml) 1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml) BHIS Medium Brain heart infusion 37 g Yeast extract 5 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Protease peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1.5 g Agar 15 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Protease peptone 3.5 g Brain heart infusion 11.1 g Yeast extract 1.5 g (NH4)2SO4 0.7 g Tris base 1.06 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). Blood agar The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 1X Phosphate buffered saline (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use. |