Optisk deteksjon av<em> E. coli</em> bakterier ved Mesoporous Silicon biosensorer
Summary
En etikett-free optisk biosensor for raske bakterier deteksjon er innført. Biosensoren er basert på en nanostrukturerte porøst Si, som er utformet til å fange opp direkte mål-bakterieceller på sin overflate. Vi benytter monoklonale antistoffer immobilisert på den porøse transduser, som fangst sonder. Våre studier demonstrerer anvendeligheten av slike biosensorer for påvisning av lave konsentrasjoner av bakterielle løpet av få minutter uten noen forutgående prøvebehandling (slik som cellelyse).
Abstract
En etikett-fri optisk biosensor basert på et nanostrukturerte porøst Si er utformet for rask lagring og påvisning av Escherichia coli K12 bakterie, som en modell mikroorganisme. Biosensoren er avhengig av direkte binding av mål-bakterieceller på sin overflate, mens ingen forbehandling (eksempel ved cellelyse) av den undersøkte prøven er nødvendig. En mesoporøst Si tynn film benyttes som den optiske transducer-element av biosensor. Under hvitt lys belysning, viser porøse laget godt løst Fabry-Perot linjemønstre i sin refleksjon spektrum. Bruk av en hurtig Fourier-transform (FFT) til refleksjon data resulterer i en enkelt topp. Endringer i intensiteten av FFT peak overvåkes. Således target bakterier fange inn på biosensor overflate, gjennom antistoff-antigen-vekselvirkninger, induserer målbare endringer i intensiteten av FFT toppene, slik at for en "sanntids" observasjon av bakterier feste.
nt "> Den mesoporøst Si film, fremstilt av en elektrokjemisk prosess anodisering, er konjugert med monoklonale antistoffer, spesifikke for mål-bakterier. Immobiliseringen, immunoactivity og spesifisitet av antistoffene blir bekreftet av fluorescerende merkingseksperimenter. Når biosensor er utsatt for mål-bakterier, blir cellene direkte tatt ut på antistoff-modifiserte, porøst Si overflate. disse spesifikke fange arrangement resultere i intensitetsendringer i den tynne filmen optisk interferens-spektrum for biosensor. Vi demonstrerer at slike biosensorer kan detektere relativt lave bakteriekonsentrasjoner (deteksjon grense på 10 4 celler / ml) på mindre enn en time.Introduction
Tidlig og nøyaktig identifisering av sykdomsfremkallende bakterier er ekstremt viktig for mat og vann sikkerhet, miljøovervåkning, og point-of-care diagnostikk en. Som tradisjonelle mikrobiologi teknikker er tidkrevende, arbeidskrevende, og mangler evnen til å oppdage mikroorganismer i "real-time" eller utenfor laboratoriemiljø, er biosensorer utvikling for å møte disse utfordringene 2-5.
I de senere årene har porøse Si (PSI) dukket opp som en lovende plattform for design av sensorer og biosensorer 6-20. I løpet av det siste tiåret en rekke studier om PSI-baserte optiske sensorer og biosensorer ble publisert 21,22. Den nanostrukturerte psi laget er typisk fremstilt ved elektrokjemisk anodisk etsing av en enkelt-krystall Si wafer. De resulterende PSI nanomaterialer utviser mange fordelaktige egenskaper, for eksempel stor overflate og gratis volum, pore størrelser som kan kontrolleres og tunbare optical egenskaper 10,16. De optiske egenskapene av PSI-lag, for eksempel photoluminescence 8,11 og hvitt lysrefleksjon basert interferometri 7,19, er sterkt påvirket av miljøforhold. Fangst av gjestemolekyler / target analytter innenfor de porøse lag resulterer i en forandring i den gjennomsnittlige brytningsindeksen for filmen, observert som en modulasjon i photoluminescence spektrum eller som et bølgelengdeskifte i reflektivitet spektrum 10..
Selv om de aller innovasjon i PSI optisk biosensor teknologi, det er bare få rapporter om PSI-baserte plattformer for bakterier deteksjon 6,8,20,23-29. I tillegg har de fleste av disse proof-of-concept studier viste "indirekte" bakterier deteksjon. Således er generelt før lysis av cellene som kreves for å trekke ut de målrettede protein / DNA-fragmenter, karakteristiske for de studerte bakterie 29. Vår tilnærming er å direkte fange målet bakterierceller bort på Psi biosensor. Derfor er monoklonale antistoffer som er spesifikke for målet bakterier, immobilisert på den porøse overflate. Binding av bakterieceller, via antistoff-antigen-vekselvirkninger, på overflaten av en biosensor indusere endringer i amplitude (intensiteten) av reflektivitet spektrum 24-26.
I dette arbeidet, kan vi rapportere om bygging av en optisk PSI-baserte biosensor og demonstrere sin søknad som en etikett fritt biosensing plattform for påvisning av Escherichia coli (E. coli) K12 bakterier (som brukes som modell mikroorganisme). Den overvåkes optiske signalet er lyset som reflekteres fra psi nanostrukturen på grunn av Fabry-Perot-tynnfilminterferens (figur 1A). Endringer i lys amplitude / intensitet er korrelert til spesifikk immobilisering av mål-bakterieceller på biosensor overflate, noe som muliggjør hurtig påvisning og kvantifisering av bakterier.
Protocol
Representative Results
Discussion
En etikett-fri optisk immunosensor, basert på et PSiO 2 nanostrukturen (et Fabry-Perot tynn film) blir fremstilt, og dets potensielle anvendbarhet som en biosensor for deteksjon bakterier er bekreftet.
Modifikasjoner og feilsøking
Et av de store problemer ved utforming av en immunosensor er mottakelighet av antistoffer til å gjennomgå uønskede endringer i konformasjon under avsetning og mønstring på det faste substrat, noe som kan føre til en redu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Israel Science Foundation (stipend nr. 1118/08 og stipend nr. 1146/12) og Minna Kroll Memorial forskningsfond. ES erkjenner takknemlig økonomisk støtte fra Russell Berrie Nanoteknologi Institute.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
| Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
| Ethanol absolute | Merck | 818760 | |
| PBS buffer solution (pH 7.4) | prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| Saline 0.85% w/v | prepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| 95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS) | Sigma Aldrich Chemicals | 175617 | |
| PEO-iodoacetyl biotin | Sigma Aldrich Chemicals | B2059 | |
| Streptavidin (SA) | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-000-114 | |
| Fluorescein (DTAF)-streptavidin | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-010-084 | |
| Biotinylated-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 011-060-003 | |
| Fluorescently tagged anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 111-095-003 | |
| Fluorescently tagged anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 115-095-003 | |
| Biotinylated E. coli antibody | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 1007 | |
| E. coli (K-12) | was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion |
References
- Velusamy, V., et al. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol. Adv. 28 (2), 232-23 (2010).
- Doyle, M. P., Beuchat, L. R., Montville, T. J. . Food Microbiol.: Fundamentals and Front. 2, (2001).
- Radke, S. M., Alocilja, E. C. A microfabricated biosensor for detecting foodborne bioterrorism agents. IEEE Sens. J. 5 (4), 744 (2005).
- Glynn, B., et al. Current and emerging molecular diagnostic technologies applicable to bacterial food safety. Int. J. of Dairy Technol. 59 (2), 126 (2006).
- Leonard, P., et al. Advances in biosensors for detection of pathogens in food and water. Enzyme Microb. Technol. 32 (1), 3 (2003).
- Alvarez, S. D., et al. Using a porous silicon photonic crystal for bacterial cell-based biosensing. Physica Status Solidi a-Applications and Materials Science. 204 (5), 1439 (2007).
- Archer, M., et al. Electrical porous silicon microarray for DNA hybridization detection. Micro- and Nanosystems. 782, 385 (2004).
- Chan, S., Horner, S. R., Fauchet, P. M., Miller, B. L. Identification of Gram Negative Bacteria Using Nanoscale Silicon Microcavities. J. Am. Chem. Soc. 123, 11797 (2001).
- Dancil, K. -. P. S., Greiner, D. P., Sailor, M. J., Canham, L. T., Sailor, M. J., Tanaka, K., Tsai, C. C. . Development of a Porous Silicon Based Biosensor. 536, 557-562 (1999).
- D’Auria, S., et al. Nanostructured silicon-based biosensors for the selective identification of analytes of social interest. J Phys – Condens Matter. 18 (33), S2019 (2006).
- de Leon, S. B., et al. Neurons culturing and biophotonic sensing using porous silicon. Appl Phys Lett. 84 (22), 4361 (2004).
- Janshoff, A., et al. Macroporous p-type silicon Fabry-Perot layers. Fabrication, characterization, and applications in biosensing. J. Am. Chem. Soc. 120 (46), 12108 (1998).
- Orosco, M. M., Pacholski, C., Miskelly, G. M., Sailor, M. J. Protein-coated porous silicon photonic crystals for amplified optical detection of protease activity. Adv. Mater. 18, 1393 (2006).
- Pacholski, C., et al. Biosensing using porous silicon double-layer interferometers: reflective interferometric Fourier transform spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 127 (33), 11636 (2005).
- Pacholski, C., et al. Reflective Interferometric Fourier Transform Spectroscopy: A Self-Compensating Label-Free Immunosensor Using Double-layers of Porous SiO2. J. Am. Chem. Soc. 128, 4250 (2006).
- Sailor, M. J., Link, J. R. Smart Dust: nanostructured devices in a grain of sand. Chem. Comm. , 1375 (2005).
- Schwartz, M. P., Alvarez, S. D., Sailor, M. J. Porous SiO2 interferometric biosensor for quantitative determination of protein interactions: Binding of protein a to immunoglobulins derived from different species. Anal. Chem. 79 (1), 327 (2007).
- Schwartz, M. i. c. h. a. e. l. P., et al. The smart petri dish: A nanostructured photonic crystal for real-time monitoring of living cells. Langmuir. 22, 7084 (2006).
- Stewart, M. P., Buriak, J. M. Chemical and biological applications of porous silicon technology. Adv. Mater. 12 (12), 859 (2000).
- Zhang, D., Alocilja, E. C. Characterization of nanoporous silicon-based DNA biosensor for the detection of Salmonella enteritidis. IEEE Sens J. 8 (5-6), 775 (2008).
- Bonanno, L. M., Segal, E. Nanostructured porous silicon-polymer-based hybrids: from biosensing to drug delivery. Nanomedicine. 6 (10), 1755 (2011).
- Jane, A., Dronov, R., Hodges, A., Voelcker, N. H. Porous silicon biosensors on the advance. Trends Biotechnol. 27 (4), 230 (2009).
- Li, S., Huang, J., Cai, L. A porous silicon optical microcavity for sensitive bacteria detection. Nanotechnology. 22 (42), 425502 (2011).
- Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E., Zahavy, E., Ordentlich, A., Yitzhaki, S., Shafferman, A. . Nano Bio-Technology for Biomedical and Diagnostics Research. 733, (2012).
- Massad-Ivanir, N., et al. Engineering Nanostructured Porous SiO2 Surfaces for Bacteria Detection via “Direct Cell Capture”. Anal. Chem. 83 (9), 3282-32 (2011).
- Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Zeidman, T., Segal, E. Construction and characterization of porous SiO2/hydrogel hybrids as optical biosensors for rapid detection of bacteria. Adv Funct Mater. 20 (14), 2269-22 (2010).
- Mathew, F. P., Alocilja, E. C. Porous silicon-based biosensor for pathogen detection. Biosens. Bioelectron. 20 (8), 1656 (2005).
- Ouyang, H., Archer, M., Fauchet, P. M. . Frontiers in Surface Nanophotonics. 133, 49 (2007).
- Ouyang, H., DeLouise, L. A., Miller, B. L., Fauchet, P. M. Label-free quantitative detection of protein using macroporous silicon photonic bandgap biosensors. Anal. Chem. 79 (4), 1502-15 (2007).
- Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (1996).
- Piervincenzi, R. T., Reichert, W. M., Hellinga, H. W. Genetic engineering of a single-chain antibody fragment for surface immobilization in an optical biosensor. Biosensors and Bioelectronics. 13 (3-4), 305 (1998).
- Saerens, D., Huang, L., Bonroy, K., Muyldermans, S. Antibody Fragments as Probe in Biosensor Development. Sensors. 8 (8), 4669 (2008).
- Shtenberg, G., et al. Picking up the Pieces: A Generic Porous Si Biosensor for Probing the Proteolytic Products of Enzymes. Anal. Chem. 85 (3), 1951 (2013).
- Bonanno, L. M., DeLouise, L. A. Steric Crowding Effects on Target Detection in an Affinity Biosensor. Langmuir. 23 (10), 5817 (2007).
- Banada, P. P., Bhunia, A. K., Mohammed, E., Zourob, S., Turner, A. P. F. . Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , 567 (2008).
- Poma, A., Whitcombe, M., Piletsky, S., Whitcombe, M. J., Piletsky, S. A. . Designing receptores for the next generation of biosensors. , 105 (2013).
- Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Development of an immunosensor based on surface plasmon resonance for enumeration of Escherichia coli in water samples. Food Res. Int. 40 (7), 803 (2007).
- Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Rapid and label-free bacteria detection by surface plasmon resonance (SPR) biosensors. Biotechn J. 4 (7), 1003 (2009).
- Skottrup, P. D., Nicolaisen, M., Justesen, A. F. Towards on-site pathogen detection using antibody-based sensors. Biosens. Bioelectron. 24 (3), 339 (2008).
- Taylor, A. D., Ladd, J., Homola, J., Jiang, S. . Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , 83 (2008).
