Måling af total calcium i neuroner ved Electron Probe røntgen Microanalysis

Summary

Dette papir beskriver anvendelsen af ​​cryoanalytical elektronmikroskopi til kvantitativ måling af total calcium indhold og fordeling på subcellulære opløsning i fysiologisk definerede biologiske prøver.

Abstract

I denne artikel de værktøjer, teknikker og instrumenter er egnede til kvantitative målinger af intracellulære elementært indhold ved hjælp af teknik kendt som elektron probe mikroanalyse (EPMA) er beskrevet. Intramitochondrial calcium er særlig fokus på grund af den afgørende rolle, at mitokondrie calciumoverfyldning spiller i neurodegenerative sygdomme. Metoden er baseret på en analyse af røntgenstråler genereret på et elektronmikroskop (EM) ved interaktion af en elektronstråle med prøven. For at bevare den native fordeling af diffusible elementer i elektronmikroskopi prøver EPMA kræver "cryofixation" af vævet efterfulgt af fremstilling af ultratynde kryosektioner. Hurtig frysning af dyrkede celler eller organotypiske skive kulturer udføres ved springet frysning i flydende ethan eller af slam frysning mod en kold metalblok, hhv. Kryosektioner nominelt 80 nm tyk skæres tør med en diamant kniv ved ca. -16076; C, monteret på carbon / pioloform-belagt kobber net, og cryotransferred ind i en cryo-EM bruge en specialiseret cryospecimen holder. Efter visuel undersøgelse og placering kortlægning ved ≤ -160 ° C, og lav elektron dosis frosne hydreret kryosektioner frysetørres ved -100 ° C i ~ 30 minutter. Organel-level billeder af tørrede kryosektioner registreres også ved lav dosis, ved hjælp af en langsom-scan CCD-kamera og subcellulære regioner af interesse udvalgt til analyse. X-stråler, der udsendes fra ROIs ved en stationær, fokuseret, høj intensitet elektron probe indsamles af en energi-Dispersive X-ray (EDX) spektrometer, behandles af hørende elektronik, og præsenteres som en X-ray spektrum, der er en plot af røntgen intensitet vs energi. Yderligere software letter: 1) identifikation af elementært komponenter ved deres "karakteristiske" peak energi og fingeraftryk, og 2) kvantitativ analyse ved ekstraktion af toparealer / baggrund. Dette papir slutter med to eksempler, der illustrerer typiskeEPMA applikationer, et, hvor mitokondrie calcium analysemetoder kritisk indsigt i mekanismerne for excitotoksisk skade og en anden, der afslørede grundlag af iskæmi modstand.

Introduction

Calciumioner er nok den vigtigste og mest alsidige cellesignalering enhed i biologi, spiller en væsentlig rolle i normale processer så forskellige som synaptisk transmission og genekspression. På den anden side, calcium er lige så vigtigt i celledød. Især calcium deregulering er en nøglefaktor i neuronal skade i slagtilfælde, Parkinsons, Alzheimers og andre neurodegenerative sygdomme ^3,5. Således er det kritisk vigtigt at forstå kvantitativt hvor calcium er fordelt inden for celler, og hvordan dette ændrer følgende fysiologiske eller patofysiologiske stimuli. Dette mål kompliceres af, at calcium dynamisk fordeles mellem to fysiske tilstande – fri i opløsning eller bundet til et underlag – og det cellulære calciumkoncentrationerne ændre sig over flere størrelsesordener som følge af stimulation.

Mens der er flere avancerede metoder til rådighed for analyse af free intracellulært calcium, er bestemmelse af total calciumkoncentrationer i bestemte intracellulære realistisk begrænset til en fremgangsmåde, nemlig elektron probe mikroanalyse (EPMA). EPMA er en teknik, at par et røntgenbillede spektrometer til et transmissionselektronmikroskop (TEM). TEM elektronkanon fokuserer en stationær, submicron elektron sonde på en subcellulær område af interesse og det element-specifikke X-stråler, der udsendes som et resultat af elektron bombardement er indsamlet og analyseret (se referencer ^{7, 4} til detaljerede tekniske anmeldelser). Fordele ved EPMA omfatter enkelt organel niveau opløsning og submillimolar følsomhed. I praksis er det dog EPMA kræver specialiserede cryotechniques og instrumenter til prøvepræparation og analyse. Her er de værktøjer, teknikker og instrumenter er egnede til måling af intracellulær calcium hjælp EPMA beskrevet. Intramitochondrial calcium er af særlig interest på grund af den afgørende rolle, at mitokondrie calciumoverfyldning spiller i neurodegenerative sygdomme.

Protocol

Den her beskrevne fremgangsmåde blev udviklet ved hjælp af specifikke instrumenter, værktøjer og software. Fordi labs ikke skal bruge den samme forsøgsopstilling er generaliseret den tilgang, hvor det er muligt. 1.. Hurtig nedfrysning Analysemetoden skal beskrives er helt afhængig af kryogene tilgange til: 1) "cryofixation" af celler eller væv på en måde, der kvantitativt bevarer fordelingen af ​​diffunderbare vævskomponenter og grundstoffer…

Representative Results

Hjerneceller opretholde typisk excitotoksisk skade som følge af den patologiske neurotransmitterfrigivelsen, der opstår under iskæmiske forhold. EPMA var afgørende for at opdage, hvordan evne neuronale mitokondrier til at udskille massive mængder af calcium ligger bag den mekanisme af skade. Den elektronmikroskop i figur 3 illustrerer udseendet af mitokondrier i frysetørrede snit af dyrkede hippocampale neuroner hurtigt frosset ned efter 30 min eksponering til en excitotoksisk stimulus (100 uM NMD…

Discussion

Den elektronmikroskop-baserede analysemetode præsenteres her giver mulighed for detektion, identifikation og kvantificering af flere elementer af biologisk interesse, herunder Na, K, P og især Ca. Disse analyser kan udføres på subcellulært, dvs intra-organel, opløsning på grund af muligheden for at lokalisere og identificere strukturer af interesse i billeder af kryosektioner fremstillet af hurtigt frosne prøver af høj kvalitet. Bemærk, at ingen farvning er forpligtet til at optage elektron billeder s…

Materials

			REAGENTS/MATERIALS
Thermanox plastic coverslips	Thermo Fischer Scientific	72280
Culture inserts	BD Falcon	353090	For 6-well plates
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Grooved
Wood applicators	EM Sciences	72300
Folding EM grids	Ted Pella	4GC100/100	100 mesh
Indium foil	Alfa Aesar	13982	0.25 mm thick
			EQUIPMENT
Plunge freezing device	Leica Microsystems	KF-80
Slam freezing device	LifeCell	CF-100
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC6
Cryoattachment for microtome	Leica Microsystems	FC6
Diamond cryotrimming tool	Diatome	Cryotrim 45
Diamond cryoknife	Diatome	Cryo 35
Antistatic device	Diatome	Hauf Static Line
Cryo electron microscope	Carl Zeiss Microscopy	EM912 Omega
EM cryo specimen holder	Gatan	CT3500
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
Image acquisition software	Olympus SIS	iTEM suite
ED x-ray detector	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
Pulse Processor	Oxford Instruments	XP-3
PCI backplane card	4pi Systems	Spectral Engine II
Desktop computer	Apple	Any OS9-compatible model
X-ray analysis software	NIST	DTSA, DTSA II
Spreadsheet software	Microsoft	Excel
			The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line. A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online. The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)