Mesure du calcium total dans les neurones par sonde électronique X-ray microanalyse
Summary
Ce document décrit l'application de la microscopie électronique cryoanalytical à la mesure quantitative de la teneur en calcium total et la répartition à la résolution subcellulaire dans des échantillons biologiques physiologiquement définies.
Abstract
Dans cet article, les outils, les techniques et les instruments appropriés pour des mesures quantitatives de contenu élémentaire intracellulaire en utilisant la technique dite de la microsonde électronique (EPMA) sont décrits. Calcium intramitochondrial est une attention particulière en raison du rôle essentiel que la surcharge calcique mitochondriale joue dans les maladies neurodégénératives. La méthode est basée sur l'analyse des rayons X générés dans un microscope électronique (EM), par l'interaction d'un faisceau d'électrons avec l'échantillon. Afin de maintenir la distribution d'éléments native diffusibles dans les échantillons en microscopie électronique, EPMA nécessite "cryofixation" du tissu suivie de la préparation de coupes cryogéniques ultraminces. La congélation rapide des cellules en culture ou des cultures de tranches organotypiques est effectuée par congélation plonger dans de l'éthane liquide ou un gel par le claquement contre un bloc de métal froid, respectivement. Cryocoupes nominalement 80 nm d'épaisseur sont coupées à sec avec un couteau de diamant à ca. -16076, C, monté sur carbone / grilles de cuivre pioloform revêtu, et cryotransferred dans un cryo-EM en utilisant un support de cryospecimen spécialisé. Après inspection visuelle et la cartographie de l'emplacement à une température ≤ 160 ° C et une faible dose d'électrons, cryosections congelés-hydraté sont lyophilisés à -100 ° C pendant ~ 30 min. les images au niveau des organites de cryosections séchées sont enregistrées, également à faible dose, au moyen d'une caméra CCD à balayage lent et les régions sous-cellulaires d'intérêt sélectionné pour analyse. les rayons X émis par ROI par une sonde fixe, concentré, à haute intensité électrons sont collectés par un X-ray à dispersion d'énergie (EDX) spectromètre, traitée par l'électronique associée, et présenté comme un spectre de rayons X, qui est un terrain de l'intensité des rayons X vs énergie. Logiciel supplémentaire facilite: 1) l'identification des composants élémentaires par leur énergie et leur empreinte digitale de pointe «caractéristiques», et 2) l'analyse quantitative par extraction de zones de pic / fond. Ce document se termine par deux exemples qui illustrent typiqueApplications EPMA, celui dans lequel l'analyse du calcium mitochondrial fourni des informations essentielles sur les mécanismes de blessures excitotoxic et un autre qui a révélé la base de la résistance à l'ischémie.
Introduction
Les ions calcium sont sans doute entité de signalisation cellulaire le plus important et polyvalent en biologie, en jouant un rôle essentiel dans les processus normaux aussi divers que la transmission synaptique et l'expression des gènes. D'autre part, le calcium est également important dans la mort cellulaire. En particulier, la déréglementation de calcium est un facteur clé dans les lésions neuronales dans l'AVC, la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer et autres maladies neurodégénératives 3,5. Ainsi, il est important de comprendre quantitativement comment le calcium est distribué dans les cellules, et comment cela change suivant stimuli physiologiques ou physiopathologiques. Ce but est compliquée par le fait que le calcium est distribué de façon dynamique entre les deux états physiques – libres en solution ou lié à un substrat – et que les concentrations en calcium cellulaire changé au cours de plusieurs ordres de grandeur à la suite d'une stimulation.
Bien qu'il existe plusieurs méthodes avancées disponibles pour l'analyse de free calcium intracellulaire, la détermination des concentrations totales de calcium dans les compartiments intracellulaires définies est réaliste limitée à une approche, à savoir, microsonde électronique (EPMA). EPMA est une technique qui couple un spectromètre à rayons X à un microscope électronique à transmission (MET). Le canon à électrons de TEM se concentre une sonde électronique fixe, submicronique sur une région subcellulaire d'intérêt et les rayons X spécifiques à un élément émis à la suite d'un bombardement d'électrons sont recueillies et analysées (voir les références 7, 4 pour les examens techniques détaillées). Avantages de l'EPMA comprennent résolution unique au niveau de l'organite et sensibilité submillimolar. En pratique, cependant, EPMA nécessite cryotechniques spécialisées et de l'instrumentation pour la préparation et l'analyse spécimen. Ici, les outils, les techniques et les instruments appropriés pour les mesures de calcium intracellulaire utilisant EPMA sont décrits. Calcium intramitochondrial est de i spécialentérêt en raison du rôle crucial que joue la surcharge de calcium mitochondrial dans les maladies neurodégénératives.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode analytique basée microscope à électron présenté ici permet la détection, l'identification et la quantification de plusieurs éléments d'intérêt biologique, notamment Na, K, P, Ca et surtout. Ces analyses peuvent être effectuées à subcellulaire, soit intra-organite, la résolution en raison de la capacité de localiser et d'identifier les structures d'intérêt dans les images de haute qualité de cryosections préparés à partir de spécimens congelés rapidement. Notez …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Mme Christine A. Winters pour une excellente assistance technique. Ce travail a été soutenu par le Programme de neurosciences de base du Programme de recherche intra-muros NINDS, NIH (Z01 NS002610).
Materials
| REAGENTS/MATERIALS | |||
| Thermanox plastic coverslips | Thermo Fischer Scientific | 72280 | |
| Culture inserts | BD Falcon | 353090 | For 6-well plates |
| Cryopins | Leica Microsystems | 16701952 | Grooved |
| Wood applicators | EM Sciences | 72300 | |
| Folding EM grids | Ted Pella | 4GC100/100 | 100 mesh |
| Indium foil | Alfa Aesar | 13982 | 0.25 mm thick |
| EQUIPMENT | |||
| Plunge freezing device | Leica Microsystems | KF-80 | |
| Slam freezing device | LifeCell | CF-100 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Cryoattachment for microtome | Leica Microsystems | FC6 | |
| Diamond cryotrimming tool | Diatome | Cryotrim 45 | |
| Diamond cryoknife | Diatome | Cryo 35 | |
| Antistatic device | Diatome | Hauf Static Line | |
| Cryo electron microscope | Carl Zeiss Microscopy | EM912 Omega | |
| EM cryo specimen holder | Gatan | CT3500 | |
| Slow-scan CCD camera, 2k x 2k | Troendle (TRS) | Sharpeye | |
| Image acquisition software | Olympus SIS | iTEM suite | |
| ED x-ray detector | Oxford Instruments | Linksystem Pentafet | |
| Pulse Processor | Oxford Instruments | XP-3 | |
| PCI backplane card | 4pi Systems | Spectral Engine II | |
| Desktop computer | Apple | Any OS9-compatible model | |
| X-ray analysis software | NIST | DTSA, DTSA II | |
| Spreadsheet software | Microsoft | Excel | |
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References
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