Måling av Total Kalsium i nevroner ved elektron Probe røntgenmikroanalyse

Summary

Dette notatet beskriver anvendelsen av cryoanalytical elektronmikroskopi til kvantitativ måling av total kalsium innhold og distribusjon på subcellulære oppløsning i fysiologisk definerte biologiske prøver.

Abstract

I denne artikkelen verktøyene, teknikker og instrumenter som er egnet for kvantitative målinger av intracellulært elementært innhold ved hjelp av den teknikk som kalles elektronsonde mikroanalyse (EPMA) er beskrevet. Intramitochondrial kalsium er et særlig fokus på grunn av den kritiske rollen som mitokondrie kalsium overbelastning spiller i nevrodegenerative sykdommer. Metoden er basert på analyse av røntgenstråler generert i et elektronmikroskop (EM) ved samvirke av en elektronstråle med prøven. For å opprettholde den opprinnelige fordeling av diffunderbare elementer i elektronmikroskopi prøver, krever EPMA "cryofixation" av vevet etterfulgt av fremstilling av ultratynne cryosections. Rask frysing av dyrkede celler eller organotypic skive kulturer utføres av plunge frysing i flytende etan eller slam frysing mot en kald metallblokk, henholdsvis. Cryosections nominelt 80 nm tykk er kuttet tørr med en diamant kniv på ca. -16076, C, montert på karbon / pioloform belagt kobber nett, og cryotransferred inn en Cryo-EM ved hjelp av en spesialisert cryospecimen holderen. Etter visuell undersøkelse og plassering kartlegging ved ≤ -160 ° C og lav elektron dose, frosne hydrert cryosections er frysetørket ved -100 ° C i ~ 30 minutter. Organelle nivå av tørkede cryosections blir registrert, også ved lav dose, ved hjelp av en treg-scan CCD-kamera og subcellulære regioner av interesse er valgt for analyse. X-stråler som sendes ut fra ROIs av et stasjonært, fokusert av høy intensitet elektronsonde blir samlet av en energi-dispersiv røntgen (EDX) spektrometer, behandlet med tilhørende elektronikk, og presentert som et røntgenspekteret, det vil si, et tomt på X-ray intensitet vs energi. Ytterligere programvaren muliggjør: 1) identifikasjon av elementkomponenter ved sine "karakteristisk" peak energier og fingeravtrykk, og 2) kvantitativ analyse ved ekstraksjon av topparealene / bakgrunn. Dette papiret konkluderer med to eksempler som illustrerer typiskeEPMA applikasjoner, en der mitokondrie kalsium analyse gitt viktig innsikt i mekanismene for eksitotoksiske skader og en annen som avslørte basis av iskemi motstand.

Introduction

Kalsiumioner er uten tvil den viktigste og allsidig celle signalisering enhet i biologi, som spiller en viktig rolle i normale prosesser så forskjellige som synaptisk overføring og genuttrykk. På den annen side er kalsium like viktig i celledød. Spesielt er kalsium deregulering en nøkkelfaktor i nevronale skader i hjerneslag, Parkinsons, Alzheimers og andre nevrodegenerative sykdommer ^3,5. Således er det av avgjørende betydning å forstå kvantitativt hvor kalsium er fordelt i celler, og hvor dette forandrer følgende fysiologiske eller pato-fysiologiske stimuli. Dette målet er komplisert ved det faktum at kalsium blir dynamisk fordelt mellom to fysiske tilstander – frie i oppløsning eller bundet til et substrat – og det cellulære kalsiumkonsentrasjonen endrer seg over flere størrelsesordener som følge av stimulering.

Mens det er flere avanserte metoder som er tilgjengelige for analyse av free intracellulært kalsium, er bestemmelse av total kalsiumkonsentrasjoner i definerte intracellulære rom realistisk begrenset til en metode, nemlig elektron probe mikroanalyse (EPMA). EPMA er en teknikk som par et røntgen spektrometer i et transmisjonselektronmikroskop (TEM). Den TEM elektronkanon fokuserer et stasjonært, submikron elektron-probe på en subcellulære området av interesse og elementspesifikke røntgenstråler som sendes ut som følge av elektron-bombardement blir samlet og analysert (se referanser ^{7, 4} for detaljerte tekniske vurderinger). Fordeler med EPMA inkluderer enkelt organelle-nivå oppløsning og submillimolar følsomhet. I praksis krever imidlertid EPMA spesialiserte cryotechniques og instrumentering for prøven fremstilling og analyse. Her er verktøy, teknikker og instrumenter som egner seg for målinger av intracellulært kalsium hjelp EPMA beskrevet. Intramitochondrial kalsium er spesielt interest på grunn av den kritiske rollen som mitokondrie kalsium overbelastning spiller i nevrodegenerative sykdommer.

Protocol

Den tilnærmingen som er beskrevet her ble utviklet ved hjelp av spesifikke instrumenter, verktøy og programvare. Fordi labs ikke skal bruke den samme eksperimentelle oppsettet tilnærmingen er generalisert der det er mulig. En. Rapid Frysing Den analytiske fremgangsmåte som skal beskrives er helt avhengig av kryogeniske metoder for: 1) "cryofixation» av celler eller vev på en måte som bevarer kvantitativt fordelingen av diffunderbart vevskomponenter og k…

Representative Results

Hjerneceller vanligvis opprettholde eksitotoksiske skade som følge av den patologiske signalstoffet utgivelsen som skjer under iskemiske tilstander. EPMA var kritisk for å finne ut hvordan muligheten for neuronal mitokondrier binder store mengder kalsium ligger til grunn for skademekanisme. Den elektronmikroskop i Figur 3 illustrerer utseendet av mitochondria in frysetørkede cryosections i dyrkede hippocampal neuroner raskt frosset etter 30 min eksponering til en eksitotoksiske stimulus (100 uM NMDA)…

Discussion

Den elektronmikroskop-basert analysemetode som presenteres her muliggjør påvisning, identifisering og kvantifisering av flere elementer av biologisk interesse, som Na, K, P, og spesielt Ca. Disse analysene kan utføres ved subcellulære, dvs. intra-organelle, oppløsning på grunn av evnen til å lokalisere og identifisere strukturer av interesse for bilder med høy kvalitet av cryosections fremstilt fra raskt frosne prøver. Legg merke til at ingen farging er nødvendig å ta opp elektron bilder sammenlign i…

Materials

			REAGENTS/MATERIALS
Thermanox plastic coverslips	Thermo Fischer Scientific	72280
Culture inserts	BD Falcon	353090	For 6-well plates
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Grooved
Wood applicators	EM Sciences	72300
Folding EM grids	Ted Pella	4GC100/100	100 mesh
Indium foil	Alfa Aesar	13982	0.25 mm thick
			EQUIPMENT
Plunge freezing device	Leica Microsystems	KF-80
Slam freezing device	LifeCell	CF-100
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC6
Cryoattachment for microtome	Leica Microsystems	FC6
Diamond cryotrimming tool	Diatome	Cryotrim 45
Diamond cryoknife	Diatome	Cryo 35
Antistatic device	Diatome	Hauf Static Line
Cryo electron microscope	Carl Zeiss Microscopy	EM912 Omega
EM cryo specimen holder	Gatan	CT3500
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
Image acquisition software	Olympus SIS	iTEM suite
ED x-ray detector	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
Pulse Processor	Oxford Instruments	XP-3
PCI backplane card	4pi Systems	Spectral Engine II
Desktop computer	Apple	Any OS9-compatible model
X-ray analysis software	NIST	DTSA, DTSA II
Spreadsheet software	Microsoft	Excel
			The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line. A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online. The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)