Medição de cálcio total em neurônios por Electron Probe X-ray Microanálise

Summary

Este artigo descreve a aplicação de microscopia eletrônica cryoanalytical para a medição quantitativa de teor de cálcio total e distribuição em resolução subcelular em espécimes biológicos fisiologicamente definidos.

Abstract

Neste artigo as ferramentas, técnicas e instrumentos adequados para medidas quantitativas de conteúdo elementar intracelular utilizando a técnica conhecida como microanálise eletrônica (EPMA) são descritos. Cálcio intramitocondrial é um foco especial por causa do papel crítico que a sobrecarga de cálcio mitocondrial desempenha nas doenças neurodegenerativas. O método baseia-se na análise de raios-X produzidos por um microscópio electrónico (EM) por interacção de um feixe de electrões com o espécime. A fim de manter a distribuição natural de elementos difusíveis em amostras de microscopia electrónica, EPMA requer "criofixação" de tecido, seguido pela preparação de criocortes ultrafinos. Congelamento rápido das células em cultura ou culturas organotípicas de fatias é realizada por imersão em etano líquido de congelação ou de congelação por bater contra um bloco de metal fria, respectivamente. Criosecções nominalmente 80 nm de espessura são cortadas seco, com uma faca de diamante em ca. -16076: C, montado no / grelhas de cobre revestidas com carbono pioloform, e cryotransferred num crio-EM usando um suporte cryospecimen especializado. Depois de inspecção visual e de mapeamento de localização no ≤ -160 ° C, e dose baixa de electrões, criocortes congeladas-hidratado são a -100 ° C durante ~ 30 min liofilizada. Imagens de nível Organelle de criosecções secos são registrados, também em baixas doses, por meio de uma câmera CCD-scan lento e regiões subcelulares de interesse selecionadas para análise. Raios-X emitidos por ROIs por um, focado, sonda de elétrons de alta intensidade estacionário são recolhidos por um raio-X de energia dispersiva (EDX) espectrômetro, processada pela eletrônica associados, e apresenta-se como um espectro de raios-X, ou seja, um lote de intensidade dos raios-X vs energia. O software adicional facilita: 1) identificação dos componentes elementares por suas "características" energias de pico e de impressões digitais e 2) análise quantitativa por extração de áreas de pico / fundo. Este artigo termina com dois exemplos que ilustram típicoAplicações EPMA, aquele em que a análise mitocondrial de cálcio fornecidos uma visão crítica sobre os mecanismos de lesão excitotoxic e outro que revelaram a base da resistência isquemia.

Introduction

Os íons de cálcio são, indiscutivelmente, a entidade sinalização celular mais importante e versátil em biologia, desempenhando um papel essencial nos processos normais tão diversas como a transmissão sináptica e expressão gênica. Por outro lado, o cálcio é igualmente importante na morte celular. Em particular, a desregulamentação de cálcio é um fator-chave na lesão neuronal no AVC, Parkinson, Alzheimer e outras doenças neurodegenerativas ^3,5. Assim, é extremamente importante para entender quantitativamente como o cálcio é distribuído no interior das células, e como isso muda após estímulos fisiológicos ou fisiopatológicos. Este objectivo é complicada pelo facto de que o cálcio é distribuído de forma dinâmica entre dois estados físicos – livre em solução ou ligada a um substrato – e que as concentrações de cálcio celular mudar ao longo de várias ordens de grandeza, como consequência da estimulação.

Embora existam vários métodos avançados disponíveis para a análise de free de cálcio intracelular, a determinação das concentrações de cálcio total em compartimentos intracelulares definidos é realisticamente limitados a uma abordagem, isto é, electrões microanálise (EPMA). EPMA é uma técnica que os casais um espectrômetro de raios-X de um microscópio eletrônico de transmissão (TEM). O canhão de elétrons TEM foca, uma sonda de elétrons submicron parado em uma região subcelular de interesse e os raios-X específicos do elemento emitidas como resultado do bombardeio de elétrons são coletados e analisados ​​(ver referências ^{7, 4} para análises técnicas detalhadas). Vantagens de EPMA incluem resolução de nível organela única e sensibilidade submillimolar. Na prática, no entanto, requer técnicas de criofixação EPMA especializados e instrumentação para a preparação e análise de amostras. Aqui, são descritas as ferramentas, técnicas e instrumentos adequados para a medição de cálcio intracelular utilizando EPMA. Cálcio intramitocondrial é de i especialnterest em conta o papel fundamental que mitocondriais execuções de sobrecarga de cálcio em doenças neurodegenerativas.

Protocol

A abordagem descrita aqui foi desenvolvido utilizando instrumentos específicos, ferramentas e software. Porque laboratórios não vai usar a mesma configuração experimental da abordagem é generalizada sempre que possível. 1. Congelação rápida O método analítico para ser descrito é absolutamente dependente abordagens criogénicos para: 1) o "criofixação" de células ou tecidos de uma maneira que preserva quantitativamente a distribuição dos …

Representative Results

As células do cérebro tipicamente sustentar lesão excitotoxic como resultado da liberação de neurotransmissores patológico que ocorre em condições de isquemia. EPMA foi fundamental para descobrir como a capacidade das mitocôndrias neuronais de sequestrar grandes quantidades de cálcio subjacente ao mecanismo de lesão. A fotografia de microscopia electrónica na Figura 3 ilustra o aparecimento de mitocôndrias nos criocortes liofilizados de neurónios do hipocampo em cultura rapidamente congela…

Discussion

O método analítico baseado em microscópio electrónico aqui apresentada permite a detecção, identificação, quantificação e de vários elementos de interesse biológico, incluindo Na, K, P, e especialmente Ca. Estas análises podem ser realizadas em subcelular, por exemplo, intra-organelos, a resolução devido à possibilidade de localizar e identificar as estruturas de interesse nas imagens de criocortes preparados a partir de amostras rapidamente congelados de elevada qualidade. Note que nenhuma colo…

Materials

			REAGENTS/MATERIALS
Thermanox plastic coverslips	Thermo Fischer Scientific	72280
Culture inserts	BD Falcon	353090	For 6-well plates
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Grooved
Wood applicators	EM Sciences	72300
Folding EM grids	Ted Pella	4GC100/100	100 mesh
Indium foil	Alfa Aesar	13982	0.25 mm thick
			EQUIPMENT
Plunge freezing device	Leica Microsystems	KF-80
Slam freezing device	LifeCell	CF-100
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC6
Cryoattachment for microtome	Leica Microsystems	FC6
Diamond cryotrimming tool	Diatome	Cryotrim 45
Diamond cryoknife	Diatome	Cryo 35
Antistatic device	Diatome	Hauf Static Line
Cryo electron microscope	Carl Zeiss Microscopy	EM912 Omega
EM cryo specimen holder	Gatan	CT3500
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
Image acquisition software	Olympus SIS	iTEM suite
ED x-ray detector	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
Pulse Processor	Oxford Instruments	XP-3
PCI backplane card	4pi Systems	Spectral Engine II
Desktop computer	Apple	Any OS9-compatible model
X-ray analysis software	NIST	DTSA, DTSA II
Spreadsheet software	Microsoft	Excel
			The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line. A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online. The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)