Kalsium Fosfat Transfection of Primary hippocampus nevroner
Summary
Utfelling med kalsiumfosfat er en praktisk og økonomisk fremgangsmåte for transfeksjon av dyrkede celler. Med optimalisering, er det mulig å bruke denne metoden på vanskelige å transfektere celler som primære nevroner. Her beskriver vi vår detaljert protokoll for kalsiumfosfat transfeksjon av hippocampus nevroner cocultured med astroglial celler.
Abstract
Utfelling med kalsiumfosfat er en praktisk og økonomisk fremgangsmåte for transfeksjon av dyrkede celler. Med optimalisering, er det mulig å bruke denne metoden på vanskelige å transfektere celler som primære nevroner. Her beskriver vi vår detaljert protokoll for kalsiumfosfat transfeksjon av hippocampus nevroner cocultured med astroglial celler.
Introduction
Primære nevroner er en av de vanskeligste celletyper å transfektere som de er postmitotic og er svært følsomme for mikro-miljøendringer. Det er fire brukte typer av metoder for uttrykk av eksogene gener og kort hårnål RNA (shRNAs) i disse cellene en. Hver har sine egne fordeler og ulemper. For eksempel er elektroporering vanligvis utført på nylig isolerte nevroner 2, som celler må overføres inn i kyvettene for transfeksjon. Virusinfeksjon kan vanligvis oppnå svært høy virkningsgrad 3, men er mer arbeidskrevende og risikofylt for operatørene. Mange lipid-mediert transfeksjon reagenser er tilgjengelig kommersielt, med varierende grad av suksess i nerveceller og ulike nivåer av cytotoksisitet.
Kalsiumfosfat transfeksjon representerer en praktisk og økonomisk metode for innføring av fremmede gener inn i nerveceller. Metoden ble først brukt til å innføre adenovirus-DNA inn i pattedyr cells av Graham og Van Der Eb (1973) 4. Transfeksjon ble utført ved å blande kalsium klorid med rekombinant DNA i en fosfatbuffer. Dette tillater dannelsen av DNA / kalsiumfosfat utfelles som, når den gradvis slippes på et monolag av celler, holder seg til celleoverflaten, blir tatt opp av endocytose og til slutt komme inn i cellekjernen 5. Denne prosessen vil føre til ekspresjon av fremmede gener innført i målcellen. Typiske effektivitet av kalsiumfosfat transfeksjon varierer mellom 0,5-5% 6-8. Imidlertid, med forsiktig optimalisering og konsistent utførelse av den eksperimentelle protokollen, er det mulig å nå en transfeksjon virkningsgrad på nesten 50%. Her beskriver vi vår detaljert protokoll for kalsiumfosfat transfeksjon av primære hippocampus nevroner, som er cocultured med astroglial celler i en sandwich-format ni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er flere viktige parametre som må kontrolleres nøye for konsekvent vellykkede transfections 10,11. Den mest kritiske parameter for kalsium fosfat transfeksjon er pH-verdien av 2x HBS, som i våre hender varierer vanligvis mellom 7,10 til 7,15. Vi anbefaler å lage tre grupper av aksjer med pH-verdier i 0,05 trinn å gjøre rede for forskjellen mellom pH-meter. Alternativt kan Clontech pattedyr transfeksjon kit gir 2x HBS som konsekvent gir god effektivitet. Vær oppmerksom på at pH-verdien i løsningen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet støttes av NIH stipend NS065183 og oppstart midler fra Rutgers Robert Wood Johnson Medical School.
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
References
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
- Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons. Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Craig, A. M., Banker, G. a. G. K. Transfecting cultured neurons. Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Alavian, K. N., et al. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).
- Zhang, Y., et al. Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P. EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11 (2001).
- Goslin, K. A. H., Banker, G., Banker, G. a. G. K. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Kohrmann, M., et al. Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons. J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).
