Använda klicka kemi för att mäta effekten av virusinfektion på Host-cell RNA-syntes
Summary
Denna metod beskriver användningen av klickar kemi för att mäta förändringar i värdcellens transkription efter infektion med Rift Valley-feber-virus (RVFV) stam MP-12. Resultaten kan visualiseras kvalitativt via fluorescensmikroskopi eller erhållas kvantitativt genom flödescytometri. Denna metod kan avpassas för användning med andra virus.
Abstract
Många RNA-virus har utvecklat förmågan att inhibera transkription värdcell som ett sätt att kringgå cellulära försvar. För studiet av dessa virus, är det därför viktigt att ha ett snabbt och tillförlitligt sätt att mäta transkriptionsaktivitet i infekterade celler. Traditionellt har transkription mätts antingen genom inkorporering av radioaktiva nukleosider såsom 3 H-uridin följt av detektering via autoradiografi eller scintillationsräkning, eller inkorporering av halogenerade uridin-analoger, såsom 5-bromouridine (BRU) följt av detektering via immunofärgning. Användningen av radioaktiva isotoper, emellertid, kräver specialiserad utrustning och är inte möjligt i ett antal laboratorie-inställningar, medan detektion av BRU kan vara besvärliga och kan lida av låg känslighet.
Den nyligen utvecklade klicka kemi, vilket innebär en kopparkatalyserad triazol formation från en azid och en alkyn, ger nu en snabb och highly känslig alternativ till dessa två metoder. Klicka kemi är en process i två steg i vilket begynnande RNA först märkas genom inkorporering av uridin analogen 5-etynyluridin (EU), följt av detektion av markören med en fluorescerande azid. Dessa azider finns som flera olika fluoroforer, vilket möjliggör ett brett spektrum av möjligheter för visualisering.
Detta protokoll beskriver en metod för att mäta transkriptionell dämpning i celler infekterade med Rift Valley-feber-virus (RVFV) stam MP-12 med hjälp klicka kemi. Samtidigt är uttrycket av virala proteiner i dessa celler bestämdes genom klassisk intracellulär immunfärgning. Steg 1 till 4 detalj en metod för att visualisera transkriptionell dämpning via fluorescensmikroskopi, medan steg 5 till 8 detalj en metod för att kvantifiera transkriptionell dämpning via flödescytometri. Detta protokoll är lätt att anpassa för användning med andra virus.
Introduction
Traditionellt har transkriptionsaktivitet mätts genom inkorporering av antingen radioaktiv (3 H-uridin) 1 eller halogenerade (BRU) 2 nukleosider i begynnande RNA. Dessa uridine analoger tas upp av celler, omvandlas till uridinproducerande trifosfat (UTP) genom nukleosid bärgning vägen, och därefter införlivas i nysyntetiserad RNA. 3 H-uridin kan detekteras genom autoradiografi, vilket kan vara tidskrävande, eller scintillation räkna, vilket kräver specialiserad utrustning. Dessutom kan användningen av radioaktiva isotoper inte vara praktiskt i ett antal laboratorie-inställningar, inklusive hög inneslutning biosäkerhet laboratorier. BRU kan upptäckas genom immunfärgning med anti-BRU-antikroppar, som kan kräva hårda permeabilization att säkerställa tillgången av antikroppen till kärnan eller partiell denaturering av RNA, som RNA sekundär struktur kan vara en steriskt hinder för antikroppsbindning.
_content "> Protokollet som beskrivs här utnyttjar den nyligen utvecklade klicka kemi 3 för att mäta transkriptionell aktivitet i celler infekterade med den RVFV stammen MP-12. Klicka kemi förlitar sig på ett mycket selektivt och effektivt koppar (I)-katalyserad cykloadditionsreaktion mellan en alkyn och en azid del 4,5. I detta protokoll är begynnande RNA i infekterade celler först märkas genom inkorporering av uridin analog EU. I ett andra steg, är den inbyggda EU upptäcks genom reaktion med en fluorescerande azid. De främsta fördelarna med denna metod är (1) att det inte kräver användning av radioaktiva isotoper och (2) att det inte kräver hårda permeabilisering eller denaturering av RNA. Med en molekylvikt på mindre än 50 Da, åtkomst av fluorescerande azid inte hindras av otillräcklig permeabilisering eller RNA sekundär struktur. Dessutom är forskarna inte begränsade i sitt val av primära antikroppar vid kombination av upptäckten av RNA med en klassiCal immunfärgning för virala proteiner.Två olika metoder beskrivs i detta protokoll: en för att visualisera transkription via fluorescensmikroskopi (steg 1-4), och en för att kvantifiera transkriptionen genom flödescytometri (steg 5-8). Båda dessa metoder kombinerar märkning av begynnande RNA med en intracellulär immunfärgning för virala proteiner, vilket möjliggör en korrelation mellan transkriptionsaktiviteten och virusinfektion på en cell för cell basis.
Författarna har framgångsrikt använt det protokoll som beskrivs här för att fastställa transkriptionell aktivitet i celler infekterade med den RVFV stammen MP-12 6, celler infekterade med olika MP-12-mutanter 7,8, 9, och celler infekterade med Toscana virus (TOSV) 10. Protokollet som beskrivs här kan enkelt anpassas för användning med olika virus och har potential att modifieras till att innefatta immunofluorescensfärgning av specifika virala eller cellulära proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den medföljande protokoll beskriver en metod för att mäta effekten av virusinfektion på värdcellens transkription via inkorporering av uridin analog EU till begynnande RNA. Denna metod har flera fördelar jämfört med tidigare metoder: den är snabb, känslig, och det behöver inte förlita sig på användningen av radioaktiva isotoper. Vidare kan förfarandet anpassas för att ge kvalitativa data genom fluorescensmikroskopi eller kvantitativa data via flödescytometri med användning av i huvudsak samma reagens. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar RB Tesh för att ge musen polyklonala anti-RVFV antiserum och M. Griffin av UTMB flödescytometri Core Facility för hjälp med flödescytometri. Detta arbete stöddes av 5 U54 AI057156 genom Västra Regional Center of Excellence, NIH R01 AI08764301, och finansiering från Sealy Centrum för utvecklingen av vaccin vid UTMB.BK stöddes av James W. McLaughlin Fellowship Fund at UTMB.OL stöddes av en Maurice R. Hilleman början av karriären karriär Investigator Award.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ethynyl-uridine | Berry & Associates | PY 7563 | dissolve in DMSO for 100 mM stock |
| 12-mm round coverslips | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| 5 ml polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Actinomycin D (ActD) | Sigma | 9415 | dissolve in DMSO for 10 mM stock |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz | sc-2323 | |
| CuSO4 | Sigma | C-8027 | dissolve in H2O for 100 mM stock |
| DAPI | Sigma | D-9542 | dissolve in H2O for 5 mg/ml stock |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled) | Invitrogen | A10270 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled) | Invitrogen | A10277 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A-5960 | dissolve in H2O for 500 mM |
| paper filter | VWRbrand | 28333-087 | |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| poly-L-lysine (MW ≥ 70000) | Sigma | P1274 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Trizma base | Sigma | T-1503 | dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| Fluorescence Microscope | e.g. Olympus IX71 | ||
| Flow Cytometer | e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa |
References
- Fakan, S. Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus. Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).
- Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies. Cytometry. 14, 455-458 (1993).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15779-15784 (2008).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective “ligation” of azides and terminal alkynes. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 41, 2596-2599 (2002).
- Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
- Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs protein of rift valley fever virus promotes posttranslational downregulation of the TFIIH subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
- Kalveram, B., et al. Rift Valley fever virus NSs inhibits host transcription independently of the degradation of dsRNA-dependent protein kinase PKR. Virology. , (2012).
- Head, J. A., Kalveram, B., Ikegami, T. Functional analysis of Rift Valley fever virus NSs encoding a partial truncation. PLoS One. 7, e45730 (2012).
- Lihoradova, O. A., et al. Characterization of Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain Encoding NSs of Punta Toro Virus or Sandfly Fever Sicilian Virus. PLoS Negl Trop Dis. 7, e2181 (2013).
- Kalveram, B., Ikegami, T. Toscana Virus NSs Protein Promotes Degradation of Double-Stranded RNA-Dependent Protein Kinase. J. Virol. , (2013).
- Schmaljohn, C., Nichol, S., Knipe, D. M., et al. . In Fields Virology. , 1741-1789 (2007).
- Le May, N., et al. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
- Caplen, H., Peters, C. J., Bishop, D. H. Mutagen-directed attenuation of Rift Valley fever virus as a method for vaccine development. J. Gen. Virol. 66, 2271-2277 (1985).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
- Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. Detection of viral RNA by fluorescence in situ hybridization (FISH). J. Vis. Exp. , e4002 (2012).
- Reich, E., Goldberg, I. H. Actinomycin and nucleic acid function. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 3, 183-234 (1964).
- Holmes, K. L., Lantz, L. M., Russ, W. Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodies. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 4 (Unit 4 2), (2001).
