सिंगल mitochondrial superoxide बरकरार दिल में चमक या की confocal इमेजिंग<em> में Vivo</em
Summary
Confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग जीवित जानवर perfused दिल या कंकाल की मांसपेशियों में एक mitochondrial घटनाओं इमेजिंग के लिए आवेदन किया है. ऐसे superoxide चमक और झिल्ली संभावित उतार चढ़ाव के रूप में एकल mitochondrial प्रक्रियाओं के वास्तविक समय की निगरानी एक physiologically प्रासंगिक संदर्भ में और रोग perturbations दौरान mitochondrial समारोह के मूल्यांकन के लिए सक्षम बनाता है.
Abstract
माइटोकांड्रिया यूकेरियोटिक प्रणालियों में ऊर्जा उत्पादन और intracellular संकेत के लिए जिम्मेदार एक महत्वपूर्ण intracellular organelle है. Mitochondrial रोग अक्सर accompanies और मानव रोग के लिए योगदान देता है. Mitochondrial समारोह और रोग का मूल्यांकन करने के लिए विकसित किया गया है कि दृष्टिकोण के बहुमत इन विट्रो या पूर्व vivo माप में पर आधारित हैं. इन प्रयोगों से परिणाम विवो में mitochondrial समारोह का निर्धारण करने में क्षमता सीमित है. यहाँ, हम vivo में एक वास्तविक समय पर ढंग से एक mitochondrial समारोह के मूल्यांकन की अनुमति देता है जो लाइव aminals में बरकरार ऊतकों की इमेजिंग, के लिए confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग का उपयोग एक उपन्यास दृष्टिकोण का वर्णन. सबसे पहले, हम mitochondrial लक्षित superoxide सूचक, चक्राकार permuted पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (MT-cpYFP) व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों उत्पन्न करते हैं. Anesthetized मीट्रिक टन cpYFP माउस एक कस्टम निर्मित मंच अनुकूलक और समय चूक छवियों च लिया जाता है पर तय हो गई हैhindlimb के उजागर कंकाल की मांसपेशियों रोम. माउस बाद में बलिदान किया है और दिल 37 डिग्री सेल्सियस पर शारीरिक समाधान के साथ Langendorff छिड़काव के लिए निर्धारित है perfused दिल confocal खुर्दबीन के मंच पर एक विशेष कक्ष में तैनात है और कोमल दबाव दिल स्थिर और दिल की धड़कन प्रेरित गति विरूपण साक्ष्य को दबाने के लिए लागू किया जाता है. Superoxide चमक प्रति सेकंड एक फ्रेम की एक आवृत्ति पर वास्तविक समय 2 डी confocal इमेजिंग से पता चला रहे हैं. छिड़काव समाधान विभिन्न श्वसन substrates या अन्य फ्लोरोसेंट संकेतक शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. छिड़काव भी ऐसे ischemia और reperfusion के रूप में रोग मॉडलों का उत्पादन करने के लिए समायोजित किया जा सकता है. इस तकनीक को बरकरार ऊतकों में और vivo में एकल माइटोकांड्रिया के समारोह का निर्धारण करने के लिए एक अनूठा तरीका है.
Introduction
Mitochondria एक सेल bioenergetics में केंद्रीय भूमिका, मुफ्त कट्टरपंथी संकेतन, redox homeostasis, आयन विनियमन, और सेल भाग्य निर्धारण 1,2 खेलते हैं. Mitochondria शिथिलता अक्सर accompanies और रोगों 3-6 के रोगजनन underlies. विशेष रूप से ऐसे दिल और कंकाल की मांसपेशियों के रूप में मांसपेशियों सिस्टम में, mitochondrial श्वसन intracellular कैल्शियम और मजबूत बल विकास 7,8 के समय पर नियमन का समर्थन करने के लिए एटीपी के बहुमत प्रदान करता है. इन मांसपेशियों अक्सर कुल सेल मात्रा का 20-40% तक कब्जा है और myofilaments 2 के बीच में "तय" कर रहे हैं कि mitochondria की एक बड़ी संख्या के अधिकारी.
कई अध्ययनों के बावजूद, विशेष रूप से vivo में और physiologically प्रासंगिक परिस्थितियों में mitochondrial समारोह विनियमन, के बारे में हमारी समझ, सीमित है. कारणों में से एक mitochondrial समारोह के मूल्यांकन के लिए विकसित की विधियों की है कि बहुमत vitr में पर भरोसा हैओ या पूर्व में इस तरह के कृत्रिम substrates के साथ पूरक पृथक mitochondria की ऑक्सीजन की खपत, और आकृति विज्ञान के माध्यम से mitochondrial समारोह का अप्रत्यक्ष दृढ़ संकल्प (जैसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी), एंजाइम गतिविधि (जैसे aconitase गतिविधि), या intracellular एटीपी के स्तर 9-11 निगरानी के रूप में विवो दृष्टिकोण, .
हाल ही में, रिश्तेदार mitochondrial संवर्धन के साथ छोटे अणु फ्लोरोसेंट संकेतक बरकरार कोशिकाओं में झिल्ली क्षमता, कैल्शियम और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS), 11-13 सहित mitochondrial संकेतों की एक झलक, प्रदान करने के लिए लागू किया गया है. इसके अलावा, कई हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) redox आधारित और आरओएस संकेतक बंटे intracellular redox या आरओएस 14-16 संकेतों के अधिक विशिष्ट मूल्यांकन प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया है. इस के अलावा, हम एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग superoxide सूचक, परिपत्र permuted पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन, और targete विकसितmitochondria (MT-cpYFP) 17 में डी यह. MT-cpYFP 515 एनएम पर दोनों उत्सर्जन चोटियों के साथ 405 या 488 एनएम पर उत्साहित किया जा सकता है. 488 एनएम उत्तेजना पर उत्सर्जन में इन विट्रो और इन विवो calibrations 17,18 में पिछले द्वारा दिखाया के रूप में superoxide के लिए विशेष रूप से उत्तरदायी है. 405 एनएम उत्तेजना में उत्सर्जन (विभिन्न परिस्थितियों में मीट्रिक टन cpYFP के उत्सर्जन और उत्तेजना स्पेक्ट्रा पर विस्तृत जानकारी के लिए रेफरी 17 में से 1 चित्रा देखें) आंतरिक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है. समय चूक confocal इमेजिंग के साथ, इस सूचक बरकरार कोशिकाओं की एकल mitochondria में superoxide चमक नामित superoxide उत्पादन घटनाओं, फोड़ पता लगाता है. Superoxide फ़्लैश mitochondrial श्वसन, साथ क्षणिक mitochondrial झिल्ली विध्रुवण और आरओएस उत्पादन 17-20 की एक समग्र समारोह के रूप में कार्य करता है. हाल ही में, हम पीयूसी-CAGGS-MT-cpYFP वेक्टर C57/BL6 पृष्ठभूमि पर 17,19 का उपयोग अखिल ऊतक मीट्रिक टन cpYFP चूहों उत्पन्न और मजबूत अभिव्यक्ति सत्यापित किया हैदिल, कंकाल की मांसपेशियों और अन्य ऊतकों (चित्रा 2) में इस सूचक के सायन. ट्रांसजेनिक चूहों अनुरोध और वाशिंगटन विश्वविद्यालय द्वारा एमटीए अनुमोदन पर रुचि शैक्षिक जांचकर्ताओं के लिए उपलब्ध हो जाएगा.
इस अध्ययन में, हम सीटू Langendorff perfused दिल में superoxide चमक की इमेजिंग के साथ ही anesthetized मीट्रिक टन cpYFP ट्रांसजेनिक चूहों 17,19 के कंकाल की मांसपेशियों में फ्लैश घटनाओं के vivo इमेजिंग में वर्णन. यह तकनीक एक physiologically प्रासंगिक हालत में या विवो 21,22 में एक mitochondrial ROS उत्पादन घटनाओं के वास्तविक समय की निगरानी की अनुमति देता है. यह ऐसी उपयुक्त फ्लोरोसेंट संकेतक के साथ झिल्ली क्षमता और कैल्शियम के रूप में अन्य एकल mitochondrial मानकों की निगरानी के लिए प्रणाली का उपयोग करने के लिए भी संभव है. Intracellular घटनाओं (जैसे कैल्शियम यात्रियों) या दिल समारोह (साथ mitochondrial समारोह के आगे, एक साथ या समानांतर मूल्यांकन जैसे. इंजेक्शन फ्रैक्शन) प्राप्त किया जा सकता है. ऐसे ischemia और reperfusion के रूप में रोग perturbations, बरकरार मायोकार्डियम में एकल mitochondrial समारोह पर तनाव के प्रभाव का आकलन करने के लिए perfused दिल के लिए लागू किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
जीवित पशु या perfused अंगों में एक mitochondrial घटनाओं इमेजिंग mitochondrial समारोह मूल्यांकन 17,19,21,22,24,25 के लिए पारंपरिक तरीकों से अधिक महत्वपूर्ण लाभ है. यहाँ वर्णित तकनीक subcellular संकल्प पर एक वास्तविक शारीरिक हालत में mitochondria…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों डीआरएस को धन्यवाद देना चाहूंगा. Heping चेंग, उनके सहायक टिप्पणियों और इस विधि को विकसित करने में तकनीकी सहायता के लिए Huiliang जांग और स्टीफन Kolwicz. इस अध्ययन एनआईएच अनुदान और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन से WW वैज्ञानिक विकास अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| REAGENTS | |||
| Blebbistatin | Toronto Research Chemicals | B592500 | |
| CaCl2 | Acros Organics | AC34961-5000 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006-500 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1 | |
| MgCl2•6H2O | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | M1880-1 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282-500 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014-1 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25 | |
| TMRM | Invitrogen | T-668 | |
| [header] | |||
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module. |
References
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