Procédé de préparation de lame pour préserver l’architecture de chromatine tridimensionnelle de cellules germinales testiculaires

Summary

Le matériau décrit ici une méthode développée pour préserver la structure tridimensionnelle de la chromatine des cellules germinales testiculaires. C’est ce qu’on a appelé la méthode de glissement tridimensionnelle (3D). Cette méthode améliore la sensibilité pour la détection des structures subnucléaires et est applicable à l’hybridation in situ par immunofluorescence, ADN et fluorescence de l’ARN (FISH).

Abstract

Au cours de la différenciation des cellules germinales testiculaires, la structure de la chromatine nucléaire change dynamiquement. Ce qui suit décrit une méthode conçue pour préserver la disposition tridimensionnelle de la chromatine des cellules germinales testiculaires trouvées chez la souris; cette méthode a été appelée méthode de glissement tridimensionnelle (3D). Dans cette méthode, les tubules testiculaires sont directement traités par une étape de perméabilisation qui élimine le matériel cytoplasmique, suivie d’une étape de fixation qui fixe les matières nucléaires. Les tubules sont ensuite dissociés, la suspension cellulaire est cytospun et les cellules adhèrent aux lames. Cette méthode améliore la sensibilité à la détection des structures subnucléaires et est applicable à l’hybridation in situ par immunofluorescence, ADN et fluorescence arn (FISH) et à la combinaison de ces méthodes de détection. À titre d’exemple d’application possible de la méthode de lame 3D, un FISH à ARN Cot-1 est montré pour détecter les ARN naissants. La méthode de lame 3D facilitera l’examen détaillé des relations spatiales entre la structure de la chromatine, l’ADN et l’ARN lors de la différenciation des cellules germinales testiculaires.

Introduction

Dans les testicules, les cellules germinales se différencient des spermatogones diploïdes par méiose en spermatozoïdes matures et haploïdes. Au cours de ce processus, la structure de la chromatine nucléaire des cellules germinales est continuellement et dynamiquement remodelée. Les étalements de surface sont couramment utilisés pour l’examen cytologique des cellules spermatogéniques individuelles. Une méthode dominante d’étalements de surface emploie un traitement hypotonique par lequel les cellules spermatogéniques individuelles sont étalées et aplatir¹. Ces conditions sont optimales pour l’analyse détaillée des chromosomes méiotiques. Des dispositifs chromosomiques tels que le statut synaptique et les foyers de recombinaison sont facilement observés utilisant cette méthode. Cependant, le traitement hypotonique perturbe l’architecture subnucléaire de chromatine, ainsi cette technique n’est pas appropriée pour l’analyse structurale des noyaux. Par conséquent, une méthode améliorée a été conçue pour préserver la structure tridimensionnelle de la chromatine des cellules germinales testiculaires. Cette méthode a été appelée méthode tridimensionnelle (3D) de diapositives (Figure 1). La méthode de lame 3D a permis la détection de la localisation naissante de l’ARN dans les noyaux car elle a été initialement optimisée pour examiner l’expression des gènes et les états de la chromatine lors de la différenciation des cellules germinales testiculaires par hybridation in situ de fluorescence de l’ARN (FISH)^2,3. Cette méthode 3D est également applicable à la combinaison de l’immunofluorescence, de l’ADN et de l’ARN FISH. De plus, cette méthode a aidé à la découverte de la chromatine sexuelle postméiotique (PMSC), un compartiment silencieux des chromosomes sexuels trouvés dans les spermatides postméiotiques².

La méthode de lame 3D a été optimisée à l’origine par la combinaison de deux étapes essentielles de préparation de la lame couramment utilisées pour la coloration nucléaire: l’étape de fixation conçue pour fixer les matières nucléaires et l’étape de perméabilisation destinée à éliminer les matériaux cytoplasmiques afin d’améliorer l’accessibilité des réactifs de coloration, tels que les anticorps et les sondes FISH. Comme décrit précédemment dans une autre publication^3,il a été déterminé que l’étape de perméabilisation doit précéder l’étape de fixation afin d’obtenir des résultats optimaux avec un faible fond cytoplasmique. Dans cette méthode de lame 3D, l’étape de perméabilisation et l’étape de fixation subséquente sont effectuées directement sur des tubules séminifères et sont suivies par la dissociation mécanique des cellules germinales avec une pince avant le cytospinning sur les lames. Une méthode alternative pour l’ARN FISH de cellules spermatogéniques a été développée dans un autre laboratoire^4. Dans cette méthode, compatible avec la méthode 3D, l’étape de perméabilisation doit précéder l’étape de fixation afin d’obtenir des résultats optimaux de l’ARN FISH.

Le protocole suivant décrit la méthode de lame 3D et fournit un exemple d’application possible, Cot-1 RNA FISH pour la détection des ARN naissants nucléaires. L’ADN cot-1 est constitué d’éléments répétitifs dans le génome. Ici, une sonde d’ADN Cot-1 est hybridée à un intron et un UTR des transcriptions naissantes, détectant ainsi les régions transcriptionnellement actives dans le noyau^5,6. Les lames 3D sont polyvalentes et peuvent être appliquées à une combinaison de techniques d’immunofluorescence, d’ADN et d’ARN FISH afin d’obtenir un examen détaillé des relations spatiales entre l’architecture de la chromatine.

Protocol

1.3D Préparation des diapositives Préparez les réactifs suivants : Tampon CSK: NaCl 100 mM, saccharose 300 mM, TUYAUX 10 mM, MgCl 3 mM2. Ajuster le pH à 6,8 avec 1 M NaOH. Stockez la mémoire tampon CSK à 4 °C. Tampon CSK avec 0,5 % de Triton X-100 : Ajouter 200 μl de Triton X-100 à 40 ml de tampon CSK. Mélanger la solution à l’aide d’un agitateur magnétique jusqu’à ce que le Triton X-100 soit complètement dissous. Conservez le tampon CSK avec 0,5 % de Triton X-1…

Representative Results

Un résultat représentatif d’une diapositive 3D est illustré à la figure 2. Dans cette expérience, Cot-1 RNA FISH a été réalisée pour détecter la transcription naissante ainsi que l’immunomarquage à l’aide d’anticorps anti CBX1 et γH2AX. Pour combiner l’ARN FISH et l’immunomarquage, l’immunomarquage a été réalisé en premier, suivi de l’ARN FISH comme décrit en3. CBX1 est une protéine d’hétérochromatine qui se localise à l’hétérochromatine péricentrom?…

Discussion

Dans la préparation de la lame 3D, l’étape de perméabilisation précède l’étape de fixation. Ces étapes sont effectuées directement sur des tubules séminifères, préservant ainsi la structure tridimensionnelle de la chromatine. Une autre option pour préserver la structure de la chromatine pour l’ARN/ADN FISH est d’effectuer l’étape de perméabilisation et l’étape de fixation simultanément. Cette technique alternative a été réalisée dans des cellules germinales marsupiales et chez des embryons…

Materials

Cot-1 DNA	Invitrogen	18440-016
Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit	Agilent	300380
Herring sperm DNA Solution	Invitrogen	15634-017
Ethanol, 200 proof (absolute)	Pharmco-AAPER	111000200
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889
Formamide deionized	American Bioanalytical	AB00600-00500
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma-Aldrich	C8532
Bovine serum albumin	Lifeblood Medical	77110-100
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	D6001
RPMI 1640	Invitrogen	A10491-01
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M0250
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	76240
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H1200
Ribonucleoside-vanadyl complex	New England Biolabs	S1402S
Illustra MicroSpin G-50 Columns	GE Healthcare	27-5330-01
Microcentrifuge	Eppendorf	5424
Forceps	VWR	300-050
Microcentrifuge tubes	Bioexpress	C-3262-1
Cytospin 3	Shandon
Coplin jar	Fisher	08-815
Superfrost /Plus Microscope Slides	Fisher	12-550-15
4-well dish	Fisher	12-566-301
Cover glass	Fisher	12-544-G
Air incubator	Revolutionary Science	RS-IF-203