Método de preparação de slides para preservar arquitetura de cromatina tridimensional de células germinativas testiculares

Summary

O material aqui descreve um método desenvolvido para preservar a estrutura de cromatina tridimensional das células germinativas testiculares. Este foi chamado de método de slides tridimensional (3D). Este método melhora a sensibilidade para detecção de estruturas subnucleares e é aplicável para imunofluorescência, DNA e fluorescência de RNA na hibridização situ (FISH).

Abstract

Durante a diferenciação das células germinativas testiculares, a estrutura da cromatina nuclear muda dinamicamente. Descreve um método projetado para preservar o arranjo tridimensional de cromatina de células germinativas testiculares encontradas em camundongos; este método foi denominado como o método de slides tridimensional (3D). Neste método, os túbulos testiculares são tratados diretamente com uma etapa de permeabilização que remove o material citoplasmático, seguido por uma etapa de fixação que fixa materiais nucleares. Os túbulos são então dissociados, a suspensão celular é citospun, e as células aderem aos slides. Este método melhora a sensibilidade para a detecção de estruturas subnucleares e é aplicável para imunofluorescência, DNA e fluorescência de RNA na hibridização situ (FISH) e a combinação desses métodos de detecção. Como exemplo de uma possível aplicação do método de slides 3D, um PEIXINHO RNA Cot-1 é mostrado para detectar RNAs nascentes. O método de slides 3D facilitará o exame detalhado das relações espaciais entre estrutura de cromatina, DNA e RNA durante a diferenciação de células germinativas testiculares.

Introduction

Em testículos, as células germinativas se diferenciam da espermatogonia diploide através da meiose em espermatozoides maduros e haploides. Durante esse processo, a estrutura de cromatina nuclear das células germinativas é continuamente e dinamicamente remodelada. As propagações superficiais são comumente usadas para o exame citológico de células espermatogênicas individuais. Um método predominante de propagação superficial emprega tratamento hipotônico pelo qual as células espermatogênicas individuais são espalhadas e achatadas¹. Estas condições são ideais para análise detalhada de cromossomos meioticos. Características cromossômicas como status sináptico e focos de recombinação são facilmente observadas usando este método. No entanto, o tratamento hipotônico interrompe a arquitetura de cromatina subnuclear, portanto essa técnica não é adequada para análise estrutural de núcleos. Consequentemente, um método melhorado foi projetado para preservar a estrutura de cromatina tridimensional das células germinativas testiculares. Este método foi denominado como o método de slides tridimensional (3D)(Figura 1). O método de slides 3D permitiu a detecção da localização nascente do RNA em núcleos porque foi inicialmente otimizado para examinar a expressão genética e os estados de cromatina durante a diferenciação de células germinativas testiculares pela fluorescência de RNA na hibridização situ (FISH)^2,3. Este método 3D também é aplicável à combinação de imunofluorescência, DNA e RNA FISH. Além disso, este método tem auxiliado na descoberta da cromatina sexual pós-amioótica (PMSC), um compartimento silencioso dos cromossomos sexuais encontrados nos espermatozoides pós-meioticos².

O método de slides 3D foi originalmente otimizado através da combinação de duas etapas essenciais de preparação de slides comumente utilizadas para coloração nuclear: a etapa de fixação projetada para fixar materiais nucleares e a etapa de permeabilização destinada a remover materiais citoplasmáticos a fim de melhorar a acessibilidade de reagentes de coloração, como anticorpos e sondas FISH. Como descrito anteriormente em outra^{publicação 3,}foi determinado que a etapa de permeabilização deve preceder a etapa de fixação, a fim de obter resultados ideais com baixo fundo citoplasmático. Neste método de slides 3D, a etapa de permeabilização e a etapa de fixação subsequente são realizadas diretamente em túbulos seminiferos e são seguidas pela dissociação mecânica de células germinativas com fórceps antes de citospinning em slides. Um método alternativo para RNA FISH de células espermatogênicas foi desenvolvido em outro laboratório⁴. Neste método, consistente com o método 3D, a etapa de permeabilização deve preceder a etapa de fixação para obter resultados ideais de RNA FISH.

O protocolo a seguir descreve o método de slides 3D e fornece um exemplo de uma possível aplicação, Cot-1 RNA FISH para a detecção de RNAs de nascente nuclear. O DNA do Cot-1 consiste em elementos repetitivos no genoma. Aqui, uma sonda de DNA Cot-1 é hibridizada para um intron e UTR das transcrições nascentes, detectando assim as regiões transcricionáriamente ativas no núcleo^5,6. Slides 3D são versáteis e podem ser aplicados a uma combinação de técnicas de imunofluorescência, DNA e RNA FISH, a fim de obter um exame detalhado das relações espaciais entre a arquitetura da cromatina.

Protocol

Preparação de slides .3D 1 Prepare os seguintes reagentes: Tampão CSK: 100 mM NaCl, 300 mM de sacarose, 10 mM PIPES, 3 mM MgCl2. Ajuste o pH para 6,8 com 1 M NaOH. Armazene o buffer CSK a 4 °C. Tampão CSK com 0,5% Triton X-100: Adicione 200 μl de Triton X-100 a 40 ml de tampão CSK. Misture a solução usando agitador magnético até que Triton X-100 esteja completamente dissolvido. Armazene o buffer CSK com 0,5% Triton X-100 a 4 °C. 4% Paraformaldeído (PFA)-PBS,…

Representative Results

Um resultado representativo de um slide 3D é mostrado na Figura 2. Neste experimento, o Cot-1 RNA FISH foi realizado para detectar transcrição nascente juntamente com a imunostaining usando anticorpos anti CBX1 e γH2AX. Para combinar RNA FISH e imunostaining, a imunostaining foi realizada primeiro, seguida por RNA FISH como descrito em3. CBX1 é uma proteína heterocromatina que localiza a heterocromatina pericentromérica e cromossomos sexuais silenciosos na meiose chamada corpo XY (ou co…

Discussion

Na preparação do slide 3D, a etapa de permeabilização precede a etapa de fixação. Essas etapas são realizadas diretamente em túbulos seminiferos, preservando assim a estrutura de cromatina tridimensional. Uma opção alternativa para preservar a estrutura de cromatina para RNA/DNA FISH é realizar a etapa de permeabilização e a etapa de fixação simultaneamente. Esta técnica alternativa tem sido realizada em células germinativas marsupiais e embriões de pré-implantação de camundongos^7,8. No en…

Materials

Cot-1 DNA	Invitrogen	18440-016
Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit	Agilent	300380
Herring sperm DNA Solution	Invitrogen	15634-017
Ethanol, 200 proof (absolute)	Pharmco-AAPER	111000200
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889
Formamide deionized	American Bioanalytical	AB00600-00500
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma-Aldrich	C8532
Bovine serum albumin	Lifeblood Medical	77110-100
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	D6001
RPMI 1640	Invitrogen	A10491-01
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M0250
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	76240
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H1200
Ribonucleoside-vanadyl complex	New England Biolabs	S1402S
Illustra MicroSpin G-50 Columns	GE Healthcare	27-5330-01
Microcentrifuge	Eppendorf	5424
Forceps	VWR	300-050
Microcentrifuge tubes	Bioexpress	C-3262-1
Cytospin 3	Shandon
Coplin jar	Fisher	08-815
Superfrost /Plus Microscope Slides	Fisher	12-550-15
4-well dish	Fisher	12-566-301
Cover glass	Fisher	12-544-G
Air incubator	Revolutionary Science	RS-IF-203