Метод подготовки слайдов для сохранения трехмерной хроматиновой архитектуры клеток яичек яичек
Summary
Материал здесь описывает метод, разработанный для сохранения трехмерной хроматиновой структуры клеток зародыша яичек. Это было подемуно трехмерным (3D) методом слайда. Этот метод повышает чувствительность для обнаружения субядерных структур и применяется для иммунофлуоресценции, ДНК и РНК флуоресценции на месте гибридизации (FISH).
Abstract
Во время дифференциации зародышевых клеток яичек структура ядерного хроматина динамически меняется. Ниже описывается метод, предназначенный для сохранения трехмерного хроматина расположение яичек зародышевых клеток, найденных у мышей; этот метод был объявлен трехмерным (3D) методом слайда. В этом методе, трубоубийства яичка сразу обработаны с шагом permeabilization который извлекает цитоплазмический материал, после этого шаг фиксации который фиксирует ядерные материалы. Трубы затем разобщены, подвеска клетки цитоспун, и клетки придерживаются слайдов. Этот метод повышает чувствительность к обнаружению субядерных структур и применим для иммунофлуоресценции, ДНК и РНК флуоресценции на месте гибридизации (FISH) и сочетание этих методов обнаружения. В качестве примера возможного применения метода 3D слайда показана РНК-6 FISH cot-1 для обнаружения зарождающихся РНК. Метод 3D слайда облегчит детальное изучение пространственных отношений между структурой хроматина, ДНК и РНК во время дифференциации зародышевых клеток яичек.
Introduction
В яичках, зародышевые клетки дифференцируют от диплоидной сперматогонии через мейоз в зрелые, гаплоидные сперматозоиды. В ходе этого процесса ядерная хроматиновая структура зародышевых клеток непрерывно и динамически реконструируются. Поверхностные спреды обычно используются для цитологического исследования отдельных сперматозоидов. Преобладающий метод поверхностных спредов использует гипотоническое лечение, с помощью которого отдельные сперматозоидные клетки распространяются исплющиваются 1. Эти условия являются оптимальными для детального анализа мейотических хромосом. Хромосомные функции, такие как синаптический статус и очаги рекомбинации, легко наблюдаются с помощью этого метода. Однако гипотоническое лечение нарушает архитектуру субядерных хроматинов, поэтому этот метод не подходит для структурного анализа ядер. Следовательно, усовершенствован метод был разработан для сохранения трехмерной хроматиновой структуры зародышевых клеток яичек. Этот метод был объявлен трехмерным (3D) методом слайда(рисунок 1). Метод 3D слайда позволил вынашить зарождающуюся локализацию РНК в ядрах, потому что он был первоначально оптимизирован для изучения экспрессии генов и хроматиновых состояний во время дифференциации клеток яичек зародыша рнк флуоресценции на месте гибридизации (FISH)2,3. Этот 3D метод также применим к сочетанию иммунофлуоресценции, ДНК и РНК FISH. Кроме того, этот метод способствовал открытию постмейотического пола хроматина (PMSC), молчаливого отсека половых хромосом, найденных в постмейотических сперматозоидах2.
Метод 3D слайда был первоначально оптимизирован за счет сочетания двух основных этапов подготовки слайдов, обычно используемых для ядерного окрашивания: шаг фиксации, предназначенный для фиксации ядерных материалов, и шаг пермеабилизации, предназначенный для удаления цитоплазмических материалов в целях повышения доступности окрашивающих реагентов, таких как антитела и зонды FISH. Как уже говорилось вдругой публикации 3,было установлено, что шаг пермеабилизации должен предшествовать этапу фиксации, чтобы получить оптимальные результаты с низким цитоплазмическим фоном. В этом методе 3D слайда, шаг промеабилизации и последующий шаг фиксации выполняются непосредственно на семенных трубочки и следуют механической диссоциации зародышевых клеток с типсами до цитоскопирования на слайдах. Альтернативный метод РНК FISH сперматозоидов был разработан в другой лаборатории4. В этом методе, в соответствии с 3D-методом, шаг пермялизации должен предшествовать этапу фиксации, чтобы получить оптимальные результаты РНК FISH.
В следующем протоколе описывается метод 3D слайда и приводится пример возможного применения, Cot-1 РНК FISH для обнаружения ядерных зарождающихся РНК. ДНК Cot-1 состоит из повторяющихся элементов генома. Здесь зонд ДНК Cot-1 гибридизирован с интроном и UTR зарождающихся транскриптов, тем самым обнаруживая транскрипционно активные области вядре 5,6. 3D слайды универсальны и могут быть применены к сочетанию иммунофлуоресценции, ДНК и РНК FISH методов для получения детального изучения пространственных отношений между хроматин архитектуры.
Protocol
Representative Results
Discussion
В подготовке 3D слайда этап пермеабилизации предшествует этапу фиксации. Эти шаги выполняются непосредственно на семенных трубочки, тем самым сохраняя трехмерную структуру хроматина. Альтернативным вариантом сохранения хроматиновой структуры для РНК/ДНК FISH является одновременное вы…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Я благодарю Джинни Т. Ли за наблюдение за этим проектом, когда я была в лаборатории Ли, и Тайлера Броэринга за редактирование рукописи. Эта работа была поддержана Basil O’Connor Starter Scholar Award от Фонда Марта Dimes и NIH Грант GM098605.
Materials
| Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 |
| Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit | Agilent |
300380 |
| Herring sperm DNA Solution | Invitrogen | 15634-017 |
| Ethanol, 200 proof (absolute) | Pharmco-AAPER | 111000200 |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 |
| Formamide deionized | American Bioanalytical | AB00600-00500 |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | C8532 |
| Bovine serum albumin | Lifeblood Medical | 77110-100 |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D6001 |
| RPMI 1640 | Invitrogen | A10491-01 |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M0250 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 76240 |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H1200 |
| Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S |
| Illustra MicroSpin G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Forceps | VWR | 300-050 |
| Microcentrifuge tubes | Bioexpress | C-3262-1 |
| Cytospin 3 | Shandon | |
| Coplin jar | Fisher | 08-815 |
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 |
| 4-well dish | Fisher | 12-566-301 |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G |
| Air incubator | Revolutionary Science | RS-IF-203 |
References
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Namekawa, S. H., et al. Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice. Curr Biol. 16, 660-667 (2006).
- Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
- Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis. Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).
- Hall, L. L., et al. An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).
- Huynh, K. D., Lee, J. T. Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos. Nature. 426, 857-862 (2003).
- Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).
- Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse. Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).
- Ichijima, Y., et al. MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells. Genes Dev. 25, 959-971 (2011).
- Sin, H. S., et al. RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids. Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).
