Bluetongue Virüs karşı Roman Antiviraller belirlenmesi için Tahliller
Summary
Sitopatik etki (CPE)-bazlı analiz, doz-yanıt tahlil ve Time-of-adisyonu (TOA) deneyi de dahil olmak üzere üç deneyleri yanı sıra, gelişmiş optimize edilmiş, doğrulanmış ve Bluetongue virüsüne karşı yeni antiviraller (BTV) tanımlamak için kullanılmıştır yeni tespit antiviraller için olası Mekanizması-of-Eylem (MoA) belirlemek gibi.
Abstract
BTV karşı potansiyel antiviral belirlemek için, biz geliştirdik optimize edilmiş ve burada sunulan üç deneyleri geçerliliği var. CPE-tabanlı tahlil, bir bileşiğin bir anti-viral etkinlik gösteren ve büyük bir bileşik librarisinin elenmesi için kullanılmıştır olup olmadığını değerlendirmek için geliştirilen ilk deney oldu. Bu arada, antiviral sitotoksisitesi da CPE temelli test kullanılarak değerlendirilebilir. Doz-yanıt deney seçilen antiviral etkinlik için aralığını belirlemek için dizayn edilmiştir,% 50 inhibitör konsantrasyonunu (IC50) ya da etkili bir konsantrasyonu (EC50), hem de sitotoksisite yelpazesini (CC 50), yani. ÖY tahlil BTV viral yaşam döngüsü veya ana hücresel makine üzerindeki olası etkisi sırasında yeni antiviral yatan mekanizmasını belirlemek için ilk MoA çalışma için kullanılmıştır. Bu deneyler, bir hücre kültürü sisteminde antiviral etkinliğinin değerlendirilmesi için çok önemli olan ve bizim yeni araştırmalara yol kullanılmaktadırBTV karşı yeni antiviral bir dizi tanımlanmasına ing.
Introduction
BTV Orbivirüs soyu, Reoviridae ailesi içinde bir prototip çift sarmallı bir RNA virüsüdür. BTV çapında 1,2 3000000000 $ / yıl kaybı, koyun, keçi, sığır ve diğer evcil hayvanlar da dahil olmak üzere evcil hayvanların en önemli hastalıklar, biridir. Egzotik BTV serotipi listelenen önemli bir hayvan patojen olan "USDA Ciddiyeti Yüksek Hayvancılık Patojenlerinin." Son zamanlarda, yeniden ortaya çıkan BTV Kuzey Avrupa'da 3,4 genelinde birçok ülkede önemli bir sığırlarda hastalık salgını ve koyunları neden oldu. , Ekonomik önem taşıyan bir sonucu olarak ve bir model sistem olarak, BTV geniş, moleküler genetik ve yapısal çalışmaların konusu olmuştur ve çeşitli aşılar geliştirilmiştir. Ancak, antiviral ilaç keşfi için tahlillerin uygun olmaması nedeniyle, BTV karşı hiçbir antiviral vardır.
Model sistem olarak BTV'ye kullanarak yeni yüksek verimli tarama (HTS) kampanyası, biz d, eveloped optimize edilmiş ve Arbovirüsler 5 karşı potansiyel geniş spektrumlu antiviral belirlemek için bir CPE-bazlı analiz valide. CPE-tabanlı tahlil, hızlı ve gözlemlenebilir CPE / apoptoz 5-7 virüslerin neden olduğu bir dizi karşı antiviral ilaç keşfi kullanılmıştır iyi bilinen bir deneyidir. Bizim sistemde, post BTV enfeksiyon, CPE HeLa, DUY ve HEK 293T 8 dahil omurgalı hücrelerinde açıktır. BTV kaynaklı CPE CellTiter Glo hücre canlılığı reaktif kiti (CTG kit) 9 dahil olmak üzere çeşitli hücre canlılığı algılama yöntemleri kullanılarak izlenebilir ve nicelendirilebilir. Bu kit, metabolik olarak aktif canlı hücrelerin varlığını işaret eder hücresel ATP miktarının göre kültür içinde canlı hücre sayısını sunulmuştur belirler. Optimum şartlarda, burada sunulan CPE-bazlı analiz "mix ve ölçmek" bir adım protokol ve istikrarlı Işıklı sinyalleri ile esneklik ile fizibilite gösterdi. Bu arada, toksik bileşikler gdrmhücre canlılığı cing bu CPE bazlı deneyde dışı bırakılacaktır. CPE-bazlı analiz ile sağlamlık ve BTV karşı antiviral ilaç keşfi için güvenilirlik göstermiştir, ve potansiyel antiviral talebi bileşik (ler altı yeni kümesinin tanımlanması için yol NIH Molecular Kütüphane Küçük Molekül Depo (MLSMR) taranması için kullanılmıştır ) 5.
Potansiyel antiviral bileşiği, CPE-bazlı analiz ile tespit edilmiştir, bu antiviral etkinliği ve sitotoksisite 2 aralığını belirlemek için on-konsantrasyon doz-yanıt deneyine tabi olması gerekir. Antiviral etkinlik,% 50 inhibe edici konsantrasyon (IC50) ya da% 50 etkili konsantrasyon (EC 50) olarak temsil edilen, esas-çizgi ve maksimum arasındaki virüs kaynaklı CPE yarım önleyen bir ilacın konsantrasyonudur. Antiviral sitotoksisitesi,% 50 sitotoksisite konsantrasyonu (CC 50), yani konsantrasyonudurtaban çizgisi ile en arasında sitotoksisitedeki% 50 uyaran bir ilacın. % 50 SI (SI 50) olarak ifade seçici endeksi (SI), virüs kaynaklı CPE karşı antiviral özgünlüğünü belirleyen CC 50 / IC50 hesaplanmaktadır. IC 50 (ya da EC 50), 50 CC ve SI değerleri, 50 bir antiviral bileşiği, kuvvetli ve daha fazla ilaç geliştirme için seçici olup olmadığını belirlemek için kritik ölçülerdir.
Bir in vitro antiviral herhangi bir aşikar toksisite göstermiştir, ancak önlenebilir virüs CPE ve üretken viral yaşam döngüsü neden olduğunda, onun Moa 2 karakterize etmek için önemlidir. Biz antiviral etkilenen viral yaşam-döngüsü olası adım (lar) belirlemek ÖY tahlilini yaparak böyle karakterizasyonu başlattı. Genel olarak, antiviral bileşiği, farklı zamanlarda öncesi ya da sonrası virüs enfeksiyonu hücrelere ilave edildi. Antiviral enfekte hücrelere ilave edildi durumunda hedef s göndermekönceki aşamada ilave edildi birine göre tep enfeksiyonun seyri sırasında, daha düşük aktiviteye sebep olur. Bu nedenle, TOD çalışma ya da viral yaşam döngüsü ya da viral yaşam çevriminde yer alan ana makine üzerinde, bir bileşiğin anti-viral etkinlik ve potansiyel hedef belirlemek için çok önemlidir.
Üç tahlilleri için, hücre canlılığı, üretici talimatlarına 5 ardından CTG kiti kullanılarak belirlenmiştir. Bu algılama sistemi çeşitli in-house yazılımı kullanılarak analiz edilebilir yeterli lüminesans sinyalleri verir. Her bir deney en az sekiz kopyaları ile üç nüsha olarak doğrulanmış ve uygulandı. Elde edilen tüm veriler için, ortalama değer (AVE), standart sapma (STDEV'leri) ve varyasyon katsayısı (CV) olmak üzere üç parametre, tahlilin sağlamlığını belirlemek için analiz edilmiştir. Tahlilin sağlamlığı belirlendikten sonra, bundan başka, veri analizi ve grafik olarak ve çeşitli biyoistatistiksel kullanılarak çizilirc aletleri 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Antiviral hit ilk tanımlanması için, antiviral ilaç keşfi ve geliştirilmesi için önemli adımlardan biri, ölçülebilir bir işaretleyici seçerek basit bir protokol geliştirme, yeterli sinyalleri ve daha az 10% CV elde içeren, sağlam deneyleri geliştirmektir. En çok biyokimyasal veya hücre bazlı ekranlar nedeniyle tarama işleminde gerekli tekrarlanabilirlik ve taranması için moleküllerinin potansiyel olarak çok sayıda, en sağlam, basit ve ucuz bir deneyde, dayanan kimyasal bir başlangıç …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje hibe 1R03MH08127-01 ve NIH S. Li 7R03MH08127-02 tarafından desteklenen ve UAB Tıp Bölümü'nden IMPACT fonları tarafından S. Li edildi. Molette Fonu ve Auburn Üniversitesi desteği takdir edilmektedir. Biz de işin sırasında Bayan Pulin Che ve Sayın Volodymyr Musiienko gelen teknik yardımların teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM medium | Gibco | 1134218 | For cell culture |
| FBS | Gibco | 16000044 | For cell culture |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 1000185 | For cell culture |
| DPBS | Gbico | 1049769 | For cell culture |
| CellTiter-Glo (CTG) kit | Promega | TB288 | For cell viability measurement |
| 70% ethanol | Fisher | S25309B | Diluted from 95% |
| Antiviral huashilcompounds | NIH MLSMR and de novo synthesis | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR cell | Developed in house | ||
| Synergy-II multi-mode microplate reader | BioTek | For luminescent signal reading | |
| MicroFlo select dispenser | BioTek | Adding cells, virus, and reagents | |
| 384-well flat-bottom microplate | CORNING | 28908031 | For cell culture |
| Gen. 5 software | BioTek | For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Version 5 | For biostatic analysis and plot |
References
- Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
- Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341 (2012).
- Meiswinkel, R., et al. The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe–the entomological perspective. Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).
- Szmaragd, C., et al. Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007. Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).
- Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus. Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).
- Noah, J. W., et al. A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals. Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).
- Che, P., Wang, L., Li, Q. The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus. Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).
- Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis. Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).
- Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
- Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds. J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).
- Harvey, T. J., et al. Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles. J. Virol. 78, 531-538 (2004).
- Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).
- Puig-Basagoiti, F., et al. Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).
- Duan, M., et al. In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide. Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).
- Ray, D., Shi, P. Y. Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development. Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).
- Severson, W. E., et al. High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2). J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).
- Severson, W. E., et al. Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library. J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).
- Bolken, T. C., et al. Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses. Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).
- Van Loock, M., et al. A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors. J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).
- Kampmann, T., et al. In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses. Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).
- Kirchmair, J., et al. Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques. Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).
