Bluetongue वायरस के खिलाफ उपन्यास antivirals की पहचान के लिए assays
Summary
कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव (सीपीई) आधारित परख, खुराक प्रतिक्रिया परख और समय के जोड़ (TOA) परख सहित तीन assays, साथ ही, विकसित अनुकूलित, मान्य है और Bluetongue वायरस के खिलाफ उपन्यास antivirals (BTV) की पहचान करने के लिए उपयोग किया गया है नव पहचान antivirals के लिए संभव तंत्र की कार्रवाई (एमओए) निर्धारित करने के रूप में.
Abstract
BTV के खिलाफ संभावित antivirals की पहचान करने के लिए, हम विकसित अनुकूलित और यहाँ प्रस्तुत तीन assays पुष्टि की है. सीपीई आधारित परख एक यौगिक किसी भी antiviral प्रभावकारिता दिखाया और बड़े परिसर पुस्तकालय स्क्रीन इस्तेमाल किया गया है कि क्या मूल्यांकन करने के लिए विकसित की पहली परख थी. इस बीच, antivirals के cytotoxicity भी सीपीई आधारित परख का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है. खुराक प्रतिक्रिया परख चयनित एंटीवायरल के लिए प्रभावकारिता की सीमा निर्धारित करने के लिए डिजाइन किया गया था, 50% निरोधात्मक एकाग्रता (आईसी 50) या प्रभावी एकाग्रता (ईसी 50), और साथ ही cytotoxicity की अपनी सीमा (सीसी 50) अर्थात्. TOA परख BTV वायरल जीवन चक्र या मेजबान सेलुलर तंत्र पर संभव प्रभाव के दौरान उपन्यास antivirals के अंतर्निहित तंत्र निर्धारित करने के लिए प्रारंभिक एमओए अध्ययन के लिए नियुक्त किया गया था. ये assays सेल संस्कृति प्रणाली में antiviral प्रभावकारिता के मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण हैं, और हमारे हाल के शोध का नेतृत्व करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैBTV के खिलाफ उपन्यास antivirals के एक नंबर की पहचान करने के लिए आईएनजी.
Introduction
BTV जीनस Orbivirus, परिवार Reoviridae में एक प्रोटोटाइप डबल असहाय शाही सेना वायरस है. BTV दुनिया भर में 1,2 $ 3000000000 / वर्ष के नुकसान के साथ, भेड़, बकरी, पशु और अन्य घरेलू पशुओं सहित घरेलू पशुओं का सबसे महत्वपूर्ण रोगों में से एक है. विदेशी BTV सीरोटाइप में सूचीबद्ध एक महत्वपूर्ण पशु रोगज़नक़ है "यूएसडीए उच्च परिणाम पशुधन रोगज़नक़ों." हाल ही में, फिर से उभरते BTV के उत्तरी यूरोप 3,4 भर में कई देशों में एक प्रमुख पशुओं में बीमारी का प्रकोप और भेड़ कारण बना हुआ है. इसके आर्थिक महत्व का एक परिणाम के रूप में और एक मॉडल प्रणाली के रूप में, BTV व्यापक, आणविक आनुवंशिक और संरचनात्मक अध्ययन का विषय रहा है, और कई टीके विकसित किया गया है. हालांकि, एंटीवायरल दवाओं की खोज के लिए उचित assays की कमी के कारण, BTV के खिलाफ उपलब्ध नहीं antivirals कर रहे हैं.
मॉडल प्रणाली के रूप BTV का उपयोग हाल ही में एक उच्च throughput स्क्रीनिंग (HTS) अभियान में, हम घ, eveloped अनुकूलित और arboviruses 5 के खिलाफ संभावित व्यापक स्पेक्ट्रम antivirals की पहचान करने के लिए एक सीपीई आधारित परख मान्य. सीपीई आधारित परख तेजी से और नमूदार सीपीई / apoptosis 5-7 प्रेरित है कि वायरस के एक नंबर के खिलाफ antiviral दवाओं की खोज में इस्तेमाल किया गया है कि एक अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त परख है. हमारी प्रणाली में, पोस्ट BTV संक्रमण, सीपीई हेला, बीएसआर, और HEK 293T 8 सहित हड्डीवाला कोशिकाओं में स्पष्ट है. BTV प्रेरित सीपीई CellTiter Glo सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक किट (CTG किट) 9 सहित विभिन्न सेल व्यवहार्यता का पता लगाने के तरीकों का उपयोग और निगरानी की मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. इस किट metabolically सक्रिय जीवित कोशिकाओं की उपस्थिति का संकेत है, जो सेलुलर एटीपी के quantitation पर आधारित संस्कृति में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या प्रस्तुत किया, निर्धारित करता है. अनुकूलित शर्तों के तहत, यहाँ प्रस्तुत सीपीई आधारित परख "मिश्रण और उपाय" एक कदम प्रोटोकॉल, और स्थिर luminescent संकेतों के साथ लचीलेपन के साथ इसकी व्यवहार्यता दिखाया. इस बीच, जहरीले यौगिकों reduसेल व्यवहार्यता cing इस सीपीई आधारित परख में बाहर रखा जाएगा. सीपीई आधारित परख इसकी मजबूती और BTV के खिलाफ antiviral दवाओं की खोज के लिए विश्वसनीयता से पता चला है, और संभावित एंटीवायरल नेतृत्व यौगिक (ओं के छह उपन्यास क्लस्टर की पहचान की जाती है जो एनआईएच आण्विक पुस्तकालय लघु अणु भंडार (MLSMR), स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ) 5.
एक संभावित antiviral यौगिक सीपीई आधारित परख का उपयोग पहचान की गई है, जब वह एंटीवायरल प्रभावकारिता और cytotoxicity 2 की सीमा निर्धारित करने के लिए दस एकाग्रता खुराक प्रतिक्रिया परख के लिए किए जाने की आवश्यकता होगी. एंटीवायरल प्रभावकारिता, 50% निरोधात्मक एकाग्रता (आईसी 50) या 50% प्रभावी एकाग्रता (ईसी 50) के रूप में प्रतिनिधित्व, आधारभूत और अधिकतम के बीच वायरस प्रेरित सीपीई आधे रास्ते को रोकता है जो एक दवा की एकाग्रता है. antivirals के cytotoxicity, 50% cytotoxicity एकाग्रता (सीसी 50) यानी, एकाग्रता हैआधारभूत और अधिकतम के बीच cytotoxicity का 50% उत्प्रेरण एक दवा की. 50% एसआई (एसआई 50) के रूप में चिह्नित चयनात्मक सूचकांक (एसआई), वायरस प्रेरित सीपीई के खिलाफ antiviral की विशिष्टता को निर्धारित करता है जो सीसी 50 / आईसी 50 से गणना की है. आईसी 50 (या चुनाव आयोग 50), सीसी 50 और एसआई 50 मानों एक antiviral यौगिक शक्तिशाली और आगे दवा के विकास के लिए चयनात्मक है कि यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण उपाय कर रहे हैं.
एक antiviral इन विट्रो में कोई प्रकट विषाक्तता से पता चला है, अभी तक रोका वायरस सीपीई और उत्पादक वायरल जीवन चक्र को प्रेरित किया, यह अपने एमओए 2 चिह्नित करने के लिए महत्वपूर्ण है. हम एंटीवायरल से प्रभावित है कि वायरल जीवन चक्र के संभावित कदम (ओं) निर्धारित करने के लिए TOA परख बाहर ले जाने से इस तरह के लक्षण वर्णन शुरू की. आम तौर पर, एंटीवायरल यौगिक अलग अलग समय पूर्व या बाद वायरस के संक्रमण में कोशिकाओं को जोड़ा गया. Antivirals संक्रमित कोशिकाओं को जोड़ा गया तो अपने लक्ष्य के लिए पोस्टपहले कदम के लिए जोड़ा गया है, जो एक की तुलना में जब चरण संक्रमण के दौरान, यह कम गतिविधि पर नतीजा होगा. इस प्रकार, TOA अध्ययन या तो वायरल जीवन चक्र या वायरल जीवन चक्र में शामिल मेजबान मशीनरी पर, एक यौगिक के antiviral प्रभावकारिता, और अपनी क्षमता को लक्ष्य निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है.
सभी तीन assays के लिए, सेल व्यवहार्यता निर्माता अनुदेश 5 निम्नलिखित CTG किट का उपयोग कर निर्धारित किया गया था. इस प्रणाली का पता लगाने के लिए विभिन्न घर में सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है कि पर्याप्त luminescence संकेत outputs. प्रत्येक परख कम से कम आठ प्रतिकृतियां के साथ तीन प्रतियों में मान्य है और प्रदर्शन किया गया था. सभी प्राप्त आंकड़ों के लिए, मतलब मूल्य (AVE), मानक विचलन (STDEV), और गुणांक भिन्नता (सीवी) सहित तीन मानकों, परख की मजबूती का निर्धारण करने के लिए विश्लेषण किया गया. परख की मजबूती निर्धारित किया गया है, डेटा आगे विश्लेषण किया और विभिन्न बायोस्टेटिक्स और ग्राफिक्स का उपयोग कर साजिश रची किया जाएगासी उपकरण 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
एंटीवायरल हिट की प्रारंभिक पहचान के लिए, एंटीवायरल दवाओं की खोज और विकास के लिए महत्वपूर्ण कदमों में से एक, एक quantifiable मार्कर का चयन एक सरल प्रोटोकॉल के विकास, पर्याप्त संकेत है और कम से कम 10% सीवी प्राप्त क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना अनुदान 1R03MH08127-01 और एनआईएच से प्र. ली को 7R03MH08127-02 के द्वारा समर्थित है, और UAB में चिकित्सा विभाग से प्रभाव निधियों द्वारा प्र. ली के लिए किया गया था. Molette फंड और Auburn विश्वविद्यालय से समर्थन की सराहना की है. हम भी काम के दौरान सुश्री पुलिन चे और श्री वलोडिमिर Musiienko से तकनीकी assistances धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM medium | Gibco | 1134218 | For cell culture |
| FBS | Gibco | 16000044 | For cell culture |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 1000185 | For cell culture |
| DPBS | Gbico | 1049769 | For cell culture |
| CellTiter-Glo (CTG) kit | Promega | TB288 | For cell viability measurement |
| 70% ethanol | Fisher | S25309B | Diluted from 95% |
| Antiviral huashilcompounds | NIH MLSMR and de novo synthesis | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR cell | Developed in house | ||
| Synergy-II multi-mode microplate reader | BioTek | For luminescent signal reading | |
| MicroFlo select dispenser | BioTek | Adding cells, virus, and reagents | |
| 384-well flat-bottom microplate | CORNING | 28908031 | For cell culture |
| Gen. 5 software | BioTek | For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Version 5 | For biostatic analysis and plot |
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