Tuberkulose og malaria er to af de mest udbredte infektioner i mennesker og store årsager til sygelighed og dødelighed i fattige befolkningsgrupper i troperne. Vi har etableret en eksperimentel model til undersøgelse af resultatet af malaria-tuberkulose coinfektion i mus efter udfordring med begge patogener via deres naturlige rute for infektion.
Coinfections forekommer naturligt på grund af den geografiske overlapning af forskellige typer af patogene organismer. Samtidige infektioner sandsynligvis modulere respons respektive immun over for hver enkelt patogen og kan derved påvirke patogenese og sygdom resultat. Smittet patienter kan også reagere forskelligt på antiinfektiøs interventioner. Coinfektion mellem tuberkulose som er forårsaget af mykobakterier og malariaparasitten Plasmodium, som begge er coendemic i mange dele af Afrika syd for Sahara, er ikke blevet undersøgt i detaljer. For at nærme sig udfordrende, men videnskabeligt og klinisk meget relevant spørgsmål, hvordan malaria-tuberkulose coinfection modulere vært immunitet og forløbet af hver sygdom, har vi etableret en eksperimentel musemodel, der giver os mulighed for at dissekere de fremkaldte immunrespons til både patogener i smittet vært . Af note, med henblik på at de fleste netop efterligner naturligt erhvervede infektioner hos mennesker, vi udfører eksperimentelinfektioner af mus med både patogener ved deres naturlige smitteveje, dvs aerosol-og myggestik, hhv.
Befolkningsgrupper er sjældent udsat for én patogen. Især i områder med høj forekomst af infektioner såsom Afrika syd for Sahara, udgør coinfections en prime, men meget undervurderet problem for folkesundheden. Tuberkulose og malaria er den mest udbredte bakterielle og parasitære infektioner hos mennesker, henholdsvis og fortsætte med at være de hyppigste årsager til sygelighed og dødelighed i fattige befolkningsgrupper i troperne. På trods af den brede geografiske overlap mellem tuberkulose og malaria og det store antal af personer med risiko for coinfection er meget lidt kendt om samspillet mellem de forskellige og ofte modvirke immunregulatorer og effektorer samtidig fremkaldt mod malaria parasitter og tuberkelbaciller i, som samtidig individer.
Gnavere modeller af blandede infektioner tillade karakterisere differential immunreaktioner mod forskellige patogener i en vært, og dermed kaste lys over den gensidige indflydelserencer modulerende patologi og klinisk resultat af den enkelte sygdom, hvilket også vil hjælpe med at identificere nye anbefalinger for behandling og forebyggelse. Vi har etableret en eksperimentel musemodel, der gør os i stand til at undersøge de forgreninger forårsaget af samtidig infektion med Mycobacterium tuberculosis (Mtb) og gnaver Plasmodium arter inden for samme host 1.. Vigtigere er det, at efterligne naturligt erhvervede infektioner hos mennesker så tæt som muligt, vores model implementerer de naturlige smitteveje anvendes af begge patogener. Tuberkulose er en luftbåren infektion, som derfor primært manifesterer sig i lungerne. Det agens, der Mtb overføres af mennesker med aktiv sygdom via aerosol rute, når de bortvise smitsomme aerosoldråber under hoste eller nysen. Således aerosol-infektion er den foretrukne metode til at efterligne naturlig infektion. Generering af luftbårne partikler, der indeholder Mtb kan opnås ved brugaf en eksponering ved indånding system. Hele Dette organ eksponering kammer tillader udsætte forsøgsdyr til Mtb-holdige smitsomme aerosoldråber (figur 1), som er inhaleret i alveolerne i lungerne, hvor infektionen er indledt 2..
Malaria på den anden side er en vektor-bårne sygdom forårsaget af protozoer, apicomplexan parasit Plasmodium der er naturligt overføres ved bid af en kvindelig Anopheline myg. Under blodmel, infektiøse sporozoiter deponeret under værtens hud og efterfølgende når leveren via blodet. Inden hepatocytter de udvikler og hurtigt formere i lever-trins schizonts. Til sidst, modne schizonts briste og frigive tusindvis af patogene første generation merozoiter i blodbanen, hvor de påbegynder en gradvis cyklus af invasion af røde blodlegemer, replikation, røde blodlegemer sprængning reinvasion 3. Plasmodium livscyklus fortdier som nogle merozoites udvikle sig de seksuelle parasitter etaper, den mandlige og kvindelige gametocytter, som kan tages op af myg i løbet af blod måltider. I myg, Plasmodium sporozoites udvikle sig inden oocyster bosat i myg midgut og i sidste ende migrere til spytkirtlerne videresender til en anden vært 3,4.
Mens der i eksperimentelle dyremodeller levering af Mtb via aerosol, og dermed mest relevante rute er meget almindeligt, har mange eksperimentelle gnaver Plasmodium infektion undersøgelser, herunder undersøgelser af malaria-tuberkulose coinfection 5-7 blevet udført ved at inficere mus med parasitized erytrocytter, hvilket giver anledning blod-trins malariainfektion samtidig udelukke klinisk tavs lever-trins fase. Men leveren fase er et obligatorisk trin under infektion og relevant for anti-plasmodial immunitet 8-11. Vi anser det derfor vigtigt at medtage den hepatiske phase for overførsel af malaria og vedligeholdelse i undersøgelser af både malaria og malaria-tuberkulose coinfection hhv. Desuden har det vist sig, at naturligt overførte sporozoiter er mere smitsom end transmitteres via nåle infektioner 12, der har foranlediget os til at etablere malariainfektion ved mosquito bite stedet for at tilføre isoleret spytkirtel afledte sporozoiter. Den eneste måde at få smitsomme myg til naturlig transmission af malaria parasitter er at bevare hele livscyklus af parasitten i både hvirveldyr vært (her mus) og myg vektor. Således adgang til insektbetingelser for parasit vedligeholdelse er uundgåelig for at udføre naturlig transmission ved bid.
Vores protokol beskrevet heri blev udviklet for at undersøge, hvordan coinfection med Plasmodium sporozoiter virkninger på kronisk tuberkulose 1. At gøre det, mus aerosol inficeret med M. tuberkulose og 40 dage senere, da M. tuberkulose har nået den kroniske fase, mus udsættes for malaria-infektiøse myg. Resultatet af både malaria og tuberkulose i samtidig havde dyrene kan følges ved at overvåge blod parasitemia og bakterier i væv, hhv. I vores protokol, vil vi beskrive i detaljer, hvordan at inficere mus med begge patogener via deres naturlige infektion rute og hvordan at bekræfte en vellykket patogen transmission. I vores hænder, den almindeligt opnåede infektion sats for både eksperimentelle infektioner er 100%. Disse protokoller kan anvendes til at studere begge infektioner separat eller, som vi gør, at modellere og studere coinfektion mellem to af de mest udfordrende smitsomme sygdomme hos mennesker. Denne model er gældende for andre Mycobacterium og gnaver Plasmodium arter ud over de, der er beskrevet i denne protokol.
Vi beskrev, hvordan mus kan produktivt inficeret med Mtb og P. berghei via deres naturlige smitteveje. Vi anvender etableret infektion protokoller til at studere eksperimentel tuberkulose 13 eller malaria 12 og for nylig har vedtaget dem til at studere coinfektion mellem Mtb og Plasmodium i musemodel 1..
De mest kritiske trin for vellykkede infektioner er transmissionen af begge patogener på de ønskede tal. Mycobakterielle lagre bør ikke være ældre end 2 år, fordi de vil miste levedygtighed over tid, og den oprindeligt fastsatte titer af bestandene vil sandsynligvis ikke længere være nøjagtig. Som følge heraf vil infektion doser være meget lavere end forventet. Derfor bør CFU titre af stamkulturer fastsættes hvert par måneder. Lige så vigtigt er det standardiserede dyrkning og generering af Mtb lagre i første omgang. Dyrkningsbetingelser, såsommedium, kosttilskud, tid og volumen bør standardiseres med henblik på at kunne sammenligne data fra forsøg med forskellige bestande af Mtb. Mykobakterier tendens til at klumpe under kultur, derfor er det vigtigt at holde dyrkningsbetingelser standardiseret, høst bakterier på samme vækstfase og resuspender ofte under alikvoteringsprocessen. Ellers kan der være en stor variation i CFU-titre og infektion resultat.
Frembringelsen af homogent inficerede myg partier er endnu et afgørende skridt. Da forskellige myg vil foder på den enkelte mus, er det vigtigt, at alle de myg, der anvendes til en infektion eksperiment kommer fra samme parti, og at kun de partier, hvor mere end 90% af myg er inficeret anvendes.
Den nuværende model kan anvendes til at dissekere immunresponser og immune modulationer i en smittet vært ved at sammenligne med de immunresponser i enkelte inficerede værter. Vi kan anvende various veletablerede metoder såsom histologi, immunhistokemi, cytometrianalyse af immun cellepopulationer eller PCR og ELISA for cytokin og kemokin opdagelse på væv eller kropsvæsker af interesse. Det skal bemærkes, at sådanne musemodeller har visse begrænsninger. Mens hovedparten af mennesker smittet med Mtb udvikle en latent infektion med ingen tegn på kliniske symptomer, mus udvikler en kronisk fremadskridende sygdom med lunge patologi. Stadig C57BL / 6 mus er relativt resistente over for Mtb infektion og ikke udvikler klassisk granulomer som observeret i tuberkulosepatienter mennesker. Som et resultat, immunopatologiske reaktioner i mus afspejler hverken latent eller aktiv human tuberkulose sygdomme på passende måde. På trods af forskellen mellem latent og kronisk sygdom hos mennesker og mus er mus været flittigt brugt til at identificere og studere vært faktorer, der styrer Mtb infektion og er værdifulde og uundværlige redskaber til at undersøgeimmunrespons i infektionssygdomme. Vigtigere er det, varierer modtagelighed for Mtb infektion betydeligt mellem almindeligt anvendte indavlede mus stammer og mere følsomme stammer såsom DBA eller C3H kan indgå i co-og single-infektion studier. Men udover de patogene arter, der er beskrevet heri, kan anvendes andre Mycobacterium arter af interesse (fx kliniske isolater). Ligeledes mens ingen enkelt malaria model kopierer alle aspekter af menneskelig sygdom forskellige musemodeller ikke ligner forskellige aspekter af naturligt erhvervet menneskelig malaria infektion. For eksempel, P. berghei ANKA og P. yoelii YM/17XL er almindeligt studerede modeller af menneskelig (P. falciparum-induceret) alvorlig malaria, med P. berghei ANKA at blive betragtet som en fremragende model for human cerebral malari s 14,15. P. berghei NK65 er en fremragende model for hyperparasitaemia og akut malaria anæmi og er for nylig blevetbeskrevet som en eksperimentel model for malaria-associeret akut lungesvigt (ARDS MA-16). Brug den beskrevne coinfection model, kunne vi for nylig viser, at samtidig P. berghei NK65 infektion forværrer kronisk tuberkulose 1.
Bortset fra at bruge forskellige gnaver malariaparasitter kan rækkefølgen og timingen af infektion begivenheder tilpasses afhængigt af den underliggende forskningsspørgsmål. I feltet kan samtidig Plasmodium infektioner være til stede på det tidspunkt, Mtb-infektion eller erhvervet senere. I begge scenarier immunrespons til Mtb og Plasmodium kan påvirkes forskelligt. Derfor kan mus være smittet med Plasmodium sporozoiter enten før eller efter Mtb-infektion. Desuden kan musene blive udfordret på forskellige tidspunkter poste Mtb infektion at vurdere virkningen af immunrespons Plasmodium-induceret på akut versus kronisktuberkulose. Vigtigere er det, når du vælger en malariaparasitten til at studere malaria-tuberkulose coinfection, bør man være opmærksom på at nogle gnaver Plasmodium stammer forårsage akut sygdom i visse musestammer og bukke under for infektion inden for kun dage eller uger, mens Mtb forårsager kronisk og langvarige infektioner hos immunkompetente mus. Derfor, timingen af coinfection er afgørende for at undgå for tidlig død forsøgsdyr.
Gradueringen af vært immunitet ved samtidig infektion med flere patogene arter forbliver dårligt forstået. Vores eksperimentelle coinfection model giver et kraftfuldt værktøj til at undersøge Mycobacterium – Plasmodium interaktion med immunsystemet hos en smittet vært og vil bidrage til vores forståelse hvordan coinfections kan påvirke patogenese, resultat sygdom, vaccinationer, immunodiagnostik og terapi.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Miriam Ester for myg avl. Dette arbejde blev støttet af in-house finansiering fra Research Center Borstel og sluttede finansiering fra Leibniz center infektion.
Buraton | Schülke | active ingredients: aldehyds (formaldehyde, glutaraldehyde, oxalaldehyde, ethyl hexanal) | |
Middlebrook 7H9 | Sigma | M0178 | For Mtb broth cultures |
Middlebrook 7H11 | BD Biosciences | 283810 | Agar medium for Mtb culture |
Middlebrook OADC enrichment medium | BD Biosciences | 212240 | Add to 7H9 and 7H11 for Mtb culture |
Staining Dish | Science Services | E62542-12 | |
24-Slide Holder w/Handle | Science Services | E62543-06 | |
Giemsas Azur-Eosin-Methylene blue solution | Merck Millipore | 109204 | |
Wright´s stain | Sigma | W0625 | |
Inhalation Exposure System | Glas-Col | ||
Nebulizer-Venturi | Glas-Col | ||
Ice cream cups | Häagen-Dazs | Used as mosquito cages | |
Metal-frame mosquito cages | BioQuip Products | 1450A |