Tuberkulose og malaria er to av de mest utbredte infeksjoner hos mennesker og viktige årsaker til sykelighet og dødelighet i fattige befolkninger i tropene. Vi etablerte en eksperimentell modellsystem for å studere utfallet av malaria-tuberkulose coinfection i mus etter utfordringen med begge patogener via deres naturlige smitteveien.
Coinfections forekommer naturlig på grunn av den geografiske overlapping av forskjellige typer av sykdomsfremkallende organismer. Samtidige infeksjoner mest sannsynlig modulere respektive immunrespons til hver enkelt patogen og kan dermed påvirke patogenesen og sykdom utfallet. Var infisert pasienter kan også svare differentially til anti-infeksiøs intervensjoner. Coinfection mellom tuberkulose som skyldes mykobakterier og malariaparasitten Plasmodium, som begge er coendemic i mange deler av Afrika sør for Sahara, er ikke undersøkt i detalj. For å nærme seg utfordrende, men vitenskapelig og klinisk svært relevant spørsmål hvordan malaria-tuberkulose coinfection modulate vert immunitet og i løpet av hver sykdom, etablerte vi en eksperimentell mus modell som gjør det mulig for oss å dissekere de fremkalte immunresponser mot begge patogener i samtidig infisert verten . Av notatet, for å de fleste nettopp ligne naturlig ervervet menneskelige infeksjoner, vi utfører eksperimentellinfeksjoner av mus med både patogener av deres naturlige ruter på infeksjon, dvs. aerosol og myggstikk, henholdsvis.
Menneskelige populasjoner er sjelden utsatt for en patogen bare. Spesielt i områder med høy forekomst av infeksjoner som Afrika sør for Sahara, coinfections representerer et godt, men svært undervurdert folkehelseproblem. Tuberkulose og malaria er de mest utbredte bakterielle og parasittinfeksjoner hos mennesker, henholdsvis, og fortsetter å være viktige årsaker til sykelighet og dødelighet i fattige befolkninger i tropene. Til tross for bred geografisk overlapp mellom tuberkulose og malaria og det store antallet personer med risiko for coinfection, er svært lite kjent om samspillet mellom de ulike og ofte motvirke immun regulatorer og effekt samtidig fremkalte mot malariaparasitter og tuberkel basiller i var infisert individer.
Gnager modeller av blandingsinfeksjoner tillate karakterdifferensialimmunreaksjoner mot forskjellige patogener i en vert, og dermed belyse den gjensidige innflytelseskjeller moduler patologi og klinisk utfall av den enkelte sykdommen, som også vil bidra til å identifisere nye anbefalinger for behandling og forebygging. Vi har etablert en eksperimentell musemodell som gjør oss i stand til å undersøke konsekvensene forårsaket av samtidig infeksjon med Mycobacterium tuberculosis (Mtb) og gnager Plasmodium arter innen samme vert en. Viktigere, for å etterligne naturlig ervervet menneskelige infeksjoner så tett som mulig, implementerer vår modell de naturlige ruter av infeksjon som brukes av begge patogener. Tuberkulose er en luftsmitte, som derfor primært manifesterer seg i lungene. Den utløsende agent, er Mtb overført av mennesker med aktiv sykdom via aerosol rute når de utvise smittsomme aerosoldråpene ved hoste eller nysing. Således, er aerosol-infeksjon metoden for valg for å etterligne naturlig infeksjon. Generering av luftbårne partikler som inneholder Mtb kan oppnås ved brukav en inhalasjon eksponering system. Det hele kroppen eksponeringskammeret tillater å utsette forsøksdyr til Mtb-holdige infeksiøse aerosoldråpene (figur 1), som blir inhalert inn i alveolene i lungene hvor infeksjonen er initiert to.
Malaria på den annen side er en vektor båret sykdom forårsaket av protozoan, apicomplexan parasitten Plasmodium som er naturlig overføres ved bitt, kvinnelig Anopheline mygg. Under blodmel, er smittsomme sporozoites deponert under vertens hud og senere når leveren via blodet. Innenfor hepatocytter de utvikler og raskt multiplisere i leveren-trinns schizonter. Til slutt, modne schizonter sprekke og frigjøre tusenvis av patogene første generasjons merozoites inn i blodstrømmen der de initierer en progressiv syklus av røde blodlegemer invasjon, replikering, rød celle ruptur, og reinvasion tre. Den Plasmodium livssyklus fortverdier som noen merozoites utvikle seg til den seksuelle parasitt stadier, de mannlige og kvinnelige gametocytes, som kan tas opp av mygg i løpet av blod måltider. I myggen, Plasmodium sporozoites utvikle innenfor oocyster bosatt i myggen midgut og til slutt migrere til spyttkjertlene for videre overføring til en annen host 3,4.
Mens i eksperimentelle dyremodeller levering av Mtb via aerosol og dermed mest relevant rute er veldig vanlig, har mange eksperimentelle gnager Plasmodium infeksjonsstudier inkludert studier på malaria-tuberkulose coinfection 5-7 er utført ved å infisere mus med parasitized erytrocytter, noe som gir opphav til blod-trinns malaria infeksjon mens utelukke klinisk lydløs leveren-scenen fasen. Imidlertid er leveren stadium en obligatorisk trinn under infeksjonen og relevant for anti-plasmodial immunitet 8-11. Vi anser det derfor viktig å inkludere lever phase av malaria overføring og vedlikehold i studier av både malaria og malaria-tuberkulose coinfection, henholdsvis. I tillegg har det blitt vist at naturlig overfør sporozoites er mer smittsomt enn de som sendes via nål infeksjoner 12, noe som fikk oss til å etablere malaria mygg bite i stedet for å injisere isolert spyttkjertel avledet sporozoites. Den eneste måten å få smittsomme mygg for naturlig overføring av malariaparasitter er å opprettholde hele livssyklusen til parasitten i både virveldyr verten (her mus) og mygg vektoren. Dermed er tilgang til en insectary for parasitt vedlikehold uunngåelig for å utføre naturlig overføring av bitt.
Vår protokoll beskrevet her ble utviklet for å undersøke hvordan coinfection med Plasmodium sporozoites virkninger på kronisk tuberkulose en. For å gjøre dette, er mus aerosol smittet med M. tuberkulose og 40 dager senere, da M. tuberkulose infeksjon har nådd kronisk fase, mus er utsatt for malaria-smittsomme mygg. Resultatet av begge malaria og tæring på de var infisert dyr kan følges ved å overvåke blod parasitemia og bakteriemengden i vev, henholdsvis. I vår protokollen, vil vi beskrive i detalj hvordan å infisere mus med både patogener via deres naturlige smitteveien og hvordan å bekrefte vellykket patogen overføring. I våre hender, er det vanligvis oppnås infeksjonsraten for både eksperimentelle infeksjoner 100%. Disse protokollene kan brukes til å studere både infeksjoner separat eller, som vi gjør, for å modellere og studere coinfection mellom to av de mest utfordrende menneskelige smittsomme sykdommer. Denne modellen er gjeldende for andre Mycobacterium og gnager Plasmodium arter utover de som er beskrevet i denne protokollen.
Vi beskrev hvordan mus kan være produktivt smittet med Mtb og P. Berghei via deres naturlige ruter av infeksjon. Vi bruker etablert infeksjon protokoller for å studere eksperimentell tuberkulose 13 eller malaria 12 og nylig vedtatt dem til å studere coinfection mellom Mtb og Plasmodium i mus modell 1.
De mest kritiske trinn for vellykket infeksjoner er overføring av begge patogener i de ønskede tall. Mykobakterielle stocks bør ikke være over 2 år, fordi de vil tape levedyktighet over tid, og den opprinnelig bestemte titer av stokken vil mest sannsynlig ikke lenger vil være nøyaktig. Som et resultat, ville infeksjonsdoser være mye lavere enn forventet. Derfor bør CFU titere av stamkulturer bestemmes hver månedene. Like viktig er den standardiserte dyrking og generering av Mtb aksjer i første omgang. Kultur tilstander sommedium, kosttilskudd, tid og volum bør være standardisert for å kunne sammenligne data fra forsøk med ulike bestander av Mtb. Mycobacteria en tendens til å klumpe seg under kultur, og derfor er det viktig å holde oppdrettsbetingelser standardisert, høste bakteriene ved samme vekstfase og resuspender ofte under aliquoting. Ellers kan det være en stor variasjon i CFU titere og infeksjon utfallet.
Den generasjonen av homogent infiserte mygg partier er et annet kritisk punkt. Siden forskjellige myggen vil mate på hver enkelt mus, er det viktig at alle de mygg som brukes for en infeksjon eksperiment kommer fra den samme batch, og at bare de partier hvor mer enn 90% av mygg er smittet benyttes.
Den nåværende modellen kan brukes til å dissekere immunreaksjoner og immunmoduleringer i en samtidig infisert verten ved å sammenligne den immunresponsen i enkelt infiserte verter. Vi kan søke various godt etablerte metoder slik som histologi, immunohistokjemi, cytometri analyse av immuncellepopulasjoner, eller i PCR-og ELISA for cytokin og chemokine deteksjon til vevs-eller kroppsvæskene av interesse. Det bør bemerkes at slike musemodeller har visse begrensninger. Mens de fleste mennesker smittet med Mtb utvikle en latent infeksjon uten tegn til kliniske symptomer, musene utvikler en kronisk sykdom med progressive lungepatologi. Likevel, C57BL / 6 mus er relativt motstandsdyktig mot Mtb infeksjon og ikke utvikle klassiske granulomer som observert i humane tuberkulosepasienter. Som et resultat, har immunpatologisk reaksjoner i mus reflektere hverken latente eller aktive human tuberkulosesykdom på riktig måte. Til tross for avviket mellom latent og kronisk sykdom hos mennesker og mus, har mus blitt mye brukt til å identifisere og studere vertsfaktorer som styrer Mtb infeksjon og er verdifulle og uunnværlig verktøy for å undersøkeimmunresponser i infeksjonssykdommer. Viktigere, mottakelighet for Mtb infeksjon varierer betydelig mellom brukte innavlede musestammer og mer følsomme stammer som DBA eller C3H kan inkluderes i co-og single-infeksjonsstudier. Dessuten, bortsett fra de patogene arter som her er beskrevet, alle andre Mycobacterium-arter av interesse (f.eks kliniske isolater) kan brukes. På samme måte, mens ingen enkelt malaria modell replikerer alle aspekter av menneskers sykdoms ulike musemodeller har likne ulike aspekter av naturlig ervervet menneskelig malaria-smitte. For eksempel, P. berghei ANKA og P. yoelii YM/17XL er mye studert modeller av menneske (P. falciparum-indusert) alvorlig malaria, med P. berghei ANKA blir ansett som en utmerket modell for human cerebral Malari s 14,15. P. berghei NK65 er en utmerket modell for hyperparasitaemia og akutt malarial anemi, og har nylig værtbeskrevet som en eksperimentell modell for malaria-assosiert akutt respiratorisk distress-syndrom (ARDS MA-16). Ved hjelp av den beskrevne coinfection modellen, kunne vi nylig viser at samtidig P. berghei NK65 infeksjon forverrer kronisk tuberkulose en.
Bortsett fra å bruke ulike gnager malariaparasitter, kan rekkefølgen og tidspunktet for infeksjon hendelser tilpasses avhengig av underliggende problemstillingen. I feltet, kan samtidig bruk av Plasmodium infeksjoner være til stede på tidspunktet for Mtb infeksjon eller ervervet senere. I begge scenarier immunresponsen til Mtb og Plasmodium kan påvirkes ulikt. Derfor kan mus være infisert med Plasmodium sporozoites enten før eller etter Mtb infeksjon. Videre kan mus bli utfordret på ulike tidspunkter legge Mtb infeksjon for å vurdere virkningen av Plasmodium-indusert immunrespons på akutt versus kronisketuberkulose. Viktigere, når du velger en malariaparasitten for å studere malaria-tuberkulose coinfection, bør man være klar over at noen gnager Plasmodium stammer forårsake akutt sykdom i enkelte musestammer og bukke til infeksjon i løpet av bare dager eller uker mens Mtb forårsaker kroniske og langvarige infeksjoner i immunocompetent mus. Derfor er timingen av coinfection avgjørende for å unngå for tidlig død av forsøksdyr.
Moduleringen av vertsimmunitet ved samtidig infeksjon med flere patogene arter forblir dårlig forstått. Vår eksperimentelle coinfection modellen gir et kraftig verktøy for å undersøke Mycobacterium – Plasmodium samspill med immunsystemet av en samtidig infisert vert og vil bidra til vår forståelse hvordan coinfections kan påvirke patogenesen, sykdom utfallet, vaksinasjon, immunodiagnostics, og terapi.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Miriam Ester for mygg avl. Dette arbeidet ble støttet av in-house finansiering fra Research Center Borstel og sluttet finansiering ved Leibniz senter infeksjon.
Buraton | Schülke | active ingredients: aldehyds (formaldehyde, glutaraldehyde, oxalaldehyde, ethyl hexanal) | |
Middlebrook 7H9 | Sigma | M0178 | For Mtb broth cultures |
Middlebrook 7H11 | BD Biosciences | 283810 | Agar medium for Mtb culture |
Middlebrook OADC enrichment medium | BD Biosciences | 212240 | Add to 7H9 and 7H11 for Mtb culture |
Staining Dish | Science Services | E62542-12 | |
24-Slide Holder w/Handle | Science Services | E62543-06 | |
Giemsas Azur-Eosin-Methylene blue solution | Merck Millipore | 109204 | |
Wright´s stain | Sigma | W0625 | |
Inhalation Exposure System | Glas-Col | ||
Nebulizer-Venturi | Glas-Col | ||
Ice cream cups | Häagen-Dazs | Used as mosquito cages | |
Metal-frame mosquito cages | BioQuip Products | 1450A |