Tuberkulos och malaria är två av de vanligaste infektioner hos människor och viktigaste orsakerna till sjuklighet och dödlighet i fattiga befolkningar i tropikerna. Vi etablerade ett experimentellt modellsystem för att studera resultatet av coinfection malaria-tuberkulos hos möss efter utmaning med både patogener via deras naturliga smittväg.
Coinfections inträffar naturligt på grund av den geografiska överlappningen av olika typer av patogena organismer. Samtidiga infektioner troligen modulera respektive immunsvar mot varje enskild patogen och kan därmed påverka patogenes och sjukdoms utfall. Coinfected patienter kan också reagera på olika sätt på anti-infektiösa ingripanden. Coinfection mellan tuberkulos som orsakas av mykobakterier och malariaparasiten Plasmodium, som båda är coendemic i många delar av Afrika söder om Sahara, har inte studerats i detalj. För att närma sig den utmanande men vetenskapligt och kliniskt mycket relevant fråga hur coinfection malaria-tuberkulos modulerar värd immunitet och kursen för varje sjukdom, etablerade vi en experimentell musmodell som tillåter oss att dissekera de framkallade immunsvar mot både patogener i koinfekterade värd . Notera, för att de flesta exakt härma naturligt förvärvade mänskliga infektioner, vi utför experimentellinfektioner i möss med både patogener genom sina naturliga smittvägar, dvs aerosol-och myggbett, respektive.
Mänskliga populationer är sällan utsatta för endast en patogen. Särskilt i områden med hög förekomst av infektioner, t.ex. Afrika söder om Sahara, coinfections utgör ett utmärkt men mycket underskattad folkhälsoproblem. Tuberkulos och malaria är de vanligaste bakterie-och parasitinfektioner hos människor, respektive och fortfarande stora orsakerna till sjuklighet och dödlighet i fattiga befolkningar i tropikerna. Trots den breda geografiska överlappningen mellan tuberkulos och malaria och det stora antalet personer som riskerar att coinfection, är mycket lite känt om samspelet mellan de olika och ofta motverkande immunregulatorer och effekten samtidigt framkallade mot malariaparasiter och tuberkelbacillerna i coinfected individer.
Gnagare modeller av blandinfektioner tillåter karakterisera differentialimmunreaktioner mot olika patogener i en värd, alltså belysa den ömsesidiga inflytandenader moduler patologi och kliniska resultatet av den enskilda sjukdomen, vilket också kommer att bidra till att identifiera nya rekommendationer för behandling och prevention. Vi har etablerat en experimentell musmodell som gör det möjligt för oss att undersöka konsekvenserna orsakade av samtidig infektion med Mycobacterium tuberculosis (Mtb) och gnagare Plasmodium arter inom samma värd 1. Viktigt är att efterlikna naturligt förvärvade infektioner hos människor så nära som möjligt, implementerar vår modell de naturliga infektionsvägarna som används av både patogener. Tuberkulos är en luftburen infektion, som därför huvudsakligen manifesteras i lungorna. Den smittämnen, är Mtb överförs av personer med aktiv sjukdom via aerosol vägen när de utvisa smitt aerosoldroppar under hostar eller nyser. Således är aerosol infektion lämplig metod för att efterlikna naturlig infektion. Generering av luftburna partiklar som innehåller Mtb kan uppnås genom användningav ett inandningsexponering systemet. Denna hela kroppen exponeringskammare tillåter exponera försöksdjur till Mtb innehållande infektiösa aerosoldroppar (figur 1), vilka inhaleras i alveolerna i lungorna där infektion initieras 2.
Malaria, å andra sidan är en vektorburen sjukdom som orsakas av protozo apicomplexan parasiten Plasmodium som naturligt överförs genom bett av en kvinnlig Anopheline mygga. Under blodmjöl, är smitt sporozoites deponerats enligt värd huden och därefter når levern via blodet. Inom hepatocyter de utvecklas och snabbt föröka sig i levern-stegs schizonter. Så småningom mogna schizonter brista och släppa tusentals patogena första generationens merozoites in i blodomloppet där de startar en progressiv cykel av röda cellinvasion, replikering, röd cell bristning, och reinvasion 3. Den Plasmodium livscykel Continderingar som vissa merozoites utvecklas till sexuella parasitstadier, de manliga och kvinnliga gametocyter, som kan tas upp av myggor under blod måltider. I mygga, Plasmodium sporozoites utvecklas inom oocystor som bor i mygga midgut och så småningom migrera till spottkörtlarna och därefter vidarebefordras till en annan värd 3,4.
Även i experimentella djurmodeller leveransen av Mtb via aerosol och därmed mest relevanta väg är mycket vanligt, har många experimentella gnagare Plasmodium infektionsstudier, inklusive studier om malaria-tuberkulos coinfection 5-7 genomförts genom att infektera möss med parasiterade erytrocyter, vilket ger upphov till blod-scenen malariainfektion medan exklusive kliniskt tysta lever-scenen fasen. Emellertid är levern skede ett obligatoriskt steg under infektion och relevant med avseende på anti-plasmodial immunitet 8-11. Vi anser det därför viktigt att inkludera lever phase för malariasmitta och underhåll i studier av både malaria och coinfection malaria-tuberkulos, respektive. Dessutom har det visats att naturligt överförda sporozoiter är mer smittsam än de överförs via nål infektioner 12, vilket föranledde oss att etablera malariainfektion genom myggbett istället för att injicera isolerad spottkörtel som härrör sporozoiter. Det enda sättet att få smittsamma myggor för naturlig överföring av malariaparasiter är att behålla hela livscykel parasiten i både vertebratvärden (här musen) och mygga vektor. Således är oundviklig tillgång till en insectary för parasit underhåll för att utföra naturlig överföring av bettet.
Vår protokoll som beskrivs här har utvecklats för att undersöka hur coinfection med Plasmodium sporozoites effekter på kronisk tuberkulos 1. För att göra detta, möss aerosol infekterade med M. tuberkulos och 40 dagar senare, då M. tuberkulosinfektion har nått den kroniska fasen, möss utsätts för malaria-smitt myggor. Resultatet av både malaria och tuberkulos i coinfected djur kan följas genom att övervaka blod parasitemia och bakteriehalten i vävnaden, respektive. I våra protokoll, beskriver vi i detalj hur man infektera möss med både patogener via deras naturliga infektionsvägen och hur för att bekräfta framgångsrik patogen överföring. I våra händer, är vanligen uppnått infektionsfrekvensen för både experimentella infektioner 100%. Dessa protokoll kan användas för att studera både infektioner separat eller, som vi gör, för att modellera och studera coinfection mellan två av de mest utmanande humana infektionssjukdomar. Denna modell är tillämplig på andra Mycobacterium och gnagare Plasmodium arter utöver de som beskrivs i detta protokoll.
Vi beskrev hur möss kan vara produktivt infekterade med Mtb och P. Berghei via deras naturliga smittvägar. Vi tillämpar etablerad infektion protokoll för att studera experimentellt tuberkulos 13 eller malaria 12 och nyligen antagit dem att studera coinfectionen mellan Mtb och Plasmodium i musmodell 1.
De mest kritiska stegen för framgångsrika infektioner är överföringen av de båda patogenerna vid önskade nummer. Mykobakteriella lager bör inte vara äldre än 2 år, eftersom de kommer att förlora lönsamhet över tiden, och den ursprungligen beslut titer av bestånden kommer sannolikt inte längre att vara korrekt. Som ett resultat, skulle infektionsdoser vara mycket lägre än förväntat. Därför bör CFU titrar av stamkulturer fastställas varannan månad. Lika viktigt är det standardiserade odling och produktion av Mtb bestånd i första hand. Odlingsbetingelser, såsommedium, kosttillskott, tid och volym bör standardiseras för att kunna jämföra data från försök med olika lager av Mtb. Mycobacteria tenderar att klumpa under odling, och därför är det viktigt att hålla odlingsbetingelser standardiserad, skörd bakterier vid samma tillväxtfasen och återsuspendera ofta under på delning. I annat fall kan det finnas en stor variation i CFU titer och infektions utfall.
Den generation av homogent infekterade mygg partier är en annan avgörande steg. Eftersom olika myggor kommer att livnära sig på varje enskild mus, är det viktigt att alla myggor som används för en infektion experiment kommer från samma parti och att endast de partier där mer än 90% av myggor smittas används.
Den nuvarande modellen kan användas för att dissekera immunsvar och immunmoduleringar i en infekterad värd genom att jämföra den med de immuna svaren i enstaka infekterade värdar. Vi kan tillämpa various väl etablerade metoder såsom histologi, immunohistokemi, cytometri analys av immuncellpopulationer, eller PCR och ELISA för cytokin-och kemokin upptäckt att vävnaden eller kroppsvätskor av intresse. Det bör noteras, att sådana musmodeller har vissa begränsningar. Medan en majoritet av människor som smittats med Mtb utveckla en latent infektion utan tecken på kliniska symtom, möss utvecklar en kronisk sjukdom med progressiv lungpatologi. Ändå C57BL / 6 möss är relativt resistenta mot Mtb infektion och inte utvecklar klassiska granulom som observerats hos patienter mänskliga tuberkulos. Som ett resultat, behöver immunopatologiska reaktioner i mus reflektera latent eller aktiv sjukdom varken humant tuberkulos på lämpligt sätt. Trots skillnaden mellan latenta och kroniska sjukdomar i människa och mus, har möss i stor utsträckning använts för att identifiera och studera värdfaktorer som styr Mtb infektion och är värdefulla och oumbärliga verktyg för att undersökaimmunsvar vid infektionssjukdomar. Viktigt mottaglighet för Mtb-infektion varierar betydligt mellan vanligen används inavlade musstammar och mer känsliga stammar såsom DBA eller C3H kan ingå i co-och singel-infektionsstudier. Bortsett från de patogena arterna som beskrivs här, andra Mycobacterium arter av intresse (t.ex. kliniska isolat) kan användas. På samma sätt, medan ingen enskild malariamodell replikerar alla aspekter av mänsklig sjukdoms olika musmodeller gör liknar olika aspekter av naturligt förvärvad mänsklig malariainfektion. Till exempel, P. berghei ANKA och P. yoelii YM/17XL är allmänt studeras modeller av mänsklig (P. falciparum-inducerad) svår malaria, med P. berghei ANKA betraktas som en utmärkt modell för human cerebral malari s 14,15. P. berghei NK65 är en utmärkt modell för hyperparasitemi och akuta malaria anemi, och har nyligen varitbeskrivs som en experimentell modell för malariaassocierad akut respiratory distress syndrome (MA-ARDS 16). Med användning av den beskrivna saminfektion modell kunde vi nyligen visat att samtidig P. berghei NK65 infektion förvärrar kronisk tuberkulos 1.
Bortsett från att använda olika gnagare malariaparasiter, kan beslutet och tidpunkten för infektionshändelser anpassas beroende på den bakomliggande frågeställningen. På fältet kan samtidig Plasmodium infektioner vara närvarande vid tidpunkten för Mtb infektion eller förvärvad senare. I båda scenarierna de immunsvar mot Mtb och Plasmodium kan påverkas på olika sätt. Därför kan möss vara infekterade med Plasmodium-sporozoiter antingen före eller efter Mtb infektion. Dessutom kan möss utmanas vid olika tidpunkter efter Mtb-infektion för att bedöma konsekvenserna av Plasmodium-inducerade immunsvar på akut kontra kroniskttuberkulos. Viktigt när man väljer en malariaparasit för att studera coinfection malaria-tuberkulos, bör man vara medveten om att vissa gnagare Plasmodium stammar orsaka akut sjukdom i vissa stammar mus och ge efter för smitta inom bara dagar eller veckor medan Mtb orsakar kronisk och långvariga infektioner hos immunkompetenta möss. Därför är avgörande tidpunkten för saminfektion i syfte att undvika för tidig död hos försöksdjur.
Moduleringen av värdimmunitet genom samtidig infektion med flera patogener arter förblir dåligt kända. Vår experimentella coinfection modellen ger ett kraftfullt verktyg för att undersöka Mycobacterium – Plasmodium interaktion med immunsystemet hos en infekterad värd och kommer att bidra till vår förståelse om hur coinfections kan påverka patogenes, sjukdoms utfall, vaccination, immundiagnostik och terapi.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Miriam Ester för mygga avel. Detta arbete stöddes av intern finansiering från Research Center Borstel och gick med finansiering från Leibniz Center infektion.
Buraton | Schülke | active ingredients: aldehyds (formaldehyde, glutaraldehyde, oxalaldehyde, ethyl hexanal) | |
Middlebrook 7H9 | Sigma | M0178 | For Mtb broth cultures |
Middlebrook 7H11 | BD Biosciences | 283810 | Agar medium for Mtb culture |
Middlebrook OADC enrichment medium | BD Biosciences | 212240 | Add to 7H9 and 7H11 for Mtb culture |
Staining Dish | Science Services | E62542-12 | |
24-Slide Holder w/Handle | Science Services | E62543-06 | |
Giemsas Azur-Eosin-Methylene blue solution | Merck Millipore | 109204 | |
Wright´s stain | Sigma | W0625 | |
Inhalation Exposure System | Glas-Col | ||
Nebulizer-Venturi | Glas-Col | ||
Ice cream cups | Häagen-Dazs | Used as mosquito cages | |
Metal-frame mosquito cages | BioQuip Products | 1450A |