Newcastle disease-virus (NDV) er blevet grundigt undersøgt i de seneste år for at udvikle nye vektorer til vaccination og behandling, blandt andre. Disse undersøgelser har været mulig på grund af teknikker til at redde rekombinant virus fra cDNA, som dem vi beskriver her.
Newcastle disease-virus (NDV), prototypen medlem af Avulavirus slægten af familien Paramyxoviridae 1, er en ikke-segmenteret, negative-sense, single-strandede, kappeklædte RNA-virus (figur 1) med potentielle anvendelser som en vektor til vaccination, og behandling af humane sygdomme. Dybdegående udforskning af disse applikationer er kun blevet muligt efter oprettelsen af teknikker til omvendt genetik at redde rekombinante vira fra plasmider, der koder deres fuldstændige genomer som cDNA 2-5. Viral cDNA kan bekvemt modificeres in vitro ved anvendelse af standard kloningsprocedurer at ændre genotype af virus og / eller til at omfatte nye transkriptionsenheder. Redning af sådanne genetisk modificerede virus giver et værdifuldt redskab til at forstå faktorer, der påvirker flere stadier af infektionen, samt giver mulighed for udvikling og forbedring af vektorer til ekspression og levering af antigenertil vaccination og terapi. Her beskriver vi en protokol til redning af rekombinante NDVs.
Newcastle disease-virus (NDV), en aviær paramyxovirus tilhører Avulavirus slægten 1, er en økonomisk relevant og dermed i vid udstrækning forsket og overvåget zoonotisk agens, der kan alvorligt påvirke fjerkræavl hele verden. Selvom det ikke er et humant patogen, NDV er også blevet grundigt undersøgt ud over dyrlægen felt både som model paramyxovirus og på grund af dens meget interessante, naturlige onkolytiske egenskaber 6. Forskning i NDV høj grad nydt godt af udviklingen af teknikker til omvendt genetik til enkelt-strandede, ikke-segmenterede negativ-sense RNA-virus, først beskrevet for rabies virus ved Conzelmann og coleagues 2. En række af genetisk modificerede NDVs, bærer fremmede gener eller modifikationer af deres vildtype genom er blevet bredt studeret lige siden. Arbejdet med disse rekombinante vira har været afgørende for at karakterisere forskellige virulensfaktorer ikke kun for NDV, men også af andre relevante humanin patogener såsom influenza A virus 7 – eller den emergente Nipah virus 8. Endvidere har en række forskellige undersøgelser undersøgt brugen af disse teknikker til at forbedre den medfødte antitumoraktivitet af NDV 6,9,10, for det meste ved at styrke de immunstimulerende egenskaber af viruset. Anden relevant forskningsområde på rekombinante NDVs har været generation af vaccinekandidater mod andre virussygdomme som influenza 5,11,12, HIV 13, mæslinger 14, SARS 15, eller at forårsaget af respiratorisk sincytial virus (RSV) 16. Blandt de forskellige bemærkelsesværdige fordele, som NDV er manglen på allerede eksisterende immunitet i befolkningsgrupper, stabiliteten af de udenlandske genetiske skær, manglende recombinatory aktivitet og samlet en høj sikkerhedsprofil kombineret med de førnævnte naturlige immunstimulerende egenskaber 17. Det er også bemærkelsesværdigt den potentielle anvendelse af rekombinante bivalente vacciner poultry, beskyttende mod både NDV og højpatogen aviær influenzavira 11,12. Dette kan være en glimrende måde at mindske chancerne for sidstnævnte breder sig fra vilde fugle til tamme dyr, og dermed også med til at forebygge en eventuel inter-specifik hoppe af den frygtede fugleinfluenza til mennesker. Endelig er reporter-udtrykkende NDV blevet anvendt til evaluering af medfødte immunresponser samt identifikation af interferon-antagonist, der kodes af flere vira 18-27.
Den redningsproces af en rekombinant, ikke-segmenteret negativ-strenget RNA-virus består dybest set på kunstigt at tvinge en virale replikationscyklus i en producerende celle ved transfektion af cDNA, der koder for den minimale infektiøse molekylære maskineri, der er kendt som ribonukleoprotein eller RNP (figur 2). De RNP'er består af den virale polymerase (P-og L-proteiner), nukleoprotein (NP) og fuldlængde antigenomiske RNA virus. Denne RNA + antigenom er the skabelon kræves til frembringelse af de komplementære RNA-genomer, som også er forbundet med resten af proteiner af viral RNP rekapitulerer samme smitsomme kompleks, et naturligt virus ville frigøre på cellens cytoplasma efter infektion (figur 2A ). Fra dette trin frem, kan den virale cyklus foregå naturligt og rekombinante virioner indkapsling de modificerede genomer, vil blive genereret (Fig. 2B). Bemærkelsesværdigt transfektion af cDNA i stedet for det antigenomiske cDNA stærkt indskrænker eller ophæver fuldstændigt redning effektivitet 2,28-30. Selv når antigenomiske cDNA transficeres, er effektiviteten af indkapsling af det rekombinante RNA i RNP'er i transficerede celler sandsynligvis meget lav. På grund af dette, rednings-protokoller for NDV omfatter ofte forskellige trin til amplifikation af de få virale partikler, der frigives fra de oprindeligt blev transficerede celler ved coculturing dem med permissive celler og / eller vedinfektion af embryonerede æg.
Forud for redning, kan cDNA'en manipuleres ved standard kloningsteknikker procedurer med henblik på at generere de ønskede modifikationer. Mens specifikke mutationer i de forskellige genprodukter og regulatoriske sekvenser af virus kan ligefrem måde opnås, mange af de offentliggjorte arbejde, der involverer rekombinant NDV har krævet tilsætning af en ny transkriptionsenhed i NDV-genomet. Ligesom andre medlemmer af paramyxovirus familie, NDV-genomet koder for otte forskellige proteiner i seks transkriptionsenheder, som udtrykkes differentielt afhængigt af deres placering i forhold til 3'-enden i en faldende gradient kritisk for den virale livscyklus 1. På grund af dette, skal placeringen af den nye transkriptionsenhed i genomet være nøje udvalgt for at opnå en balance mellem ekspressionen af transgenet og nedskrivning af viral replikation. Indsættelse mellem P-og M-gener er blevet brugt mest, tHough andre steder er også blevet testet 13,31.
Uanset indsatsen, kloning i NDV-cDNA skal følge nogle regler for at generere en rescuable konstruktion: (i) et nyt gen, der skal indbefattes i NDV-genomet skal være under kontrol af de passende signaler til den virale RNA-afhængige RNA- polymerase. Disse sekvenser skal tilføjes opstrøms for den nye åbne læseramme (ORF), så polymerasen kan genkende slutningen af den foregående gen (GE) og begyndelsen af det nye transgen (GS), adskilt af en enkelt intergenisk sekvens nukleotid (IG) . Tilsætning af en gyldig Kozak (K)-sekvens for at forbedre eukaryote ribosomale oversættelse anbefales også til bedre fremmed protein ekspression 32, (ii) en effektiv replikation af NDV, som for de fleste medlemmer af Paramyxoviridae-familien, er afhængig af genomet længde er multiplum af seks 33, og derfor enhver indsættelse i NDV skal følge denne "regel af seks". Hvis det er nødvendigt, required yderligere nukleotider kan tilsættes nedstrøms den nye ORF, og (iii) sekvensen af transgenet bør kontrolleres for at finde mulige GE og GS lignende sekvenser, som kan påvirke redning effektivitet, transgen ekspression og / eller virus levedygtighed. Hvis til stede, skal disse sekvenser fjernes ved stum mutagenese. Fremstillingen af rekombinant fuld længde cDNA efter ovennævnte regler er det første skridt med henblik på effektivt at producere en genetisk modificeret NDV som beskrevet her.
I systemet alle DNA-konstruktioner under kontrol af T7-RNA-polymerase-promotor (figur 3). Denne cytoplasmatisk polymerase tilvejebringes i trans ved coinfektion med et rekombinant modificeret vaccinia Ankara-virus (MVA-T7) 34 Figur 3A viser pNDV-B1 plasmid, der koder for fuldlængde-antigenomiske cDNA 5.. 3B viser pTM1 plasmider kodende for NP, P-og L ORF'er. Plasmider pCITE-GFP, som koder for ufter T7 promotoren, grønt fluorescerende protein (GFP) og pCAGGS GFP 18, som koder for den samme ORF under chicken beta-actin-promotor 35, anvendes som kontroller. I denne protokol viser vi procedure at redde rekombinant NDV fra cDNA'et af lentogene NDV-stamme Hitchner B1 5 (figur 4).
Flere faktorer skal tages i betragtning for at opnå gode resultater, mens redde NDV. For det første fuldlængde-cDNA-konstruktion, der skal anvendes skal være udformet således, at den funktionelle integrering af de nye transgener / ændringer i NDV-genomet. Det betyder, som nævnt ovenfor, at (i) passende gen ende (GE), intergen (IG) og gen-start (GS) sekvenser der skal tilføjes, hvis det kræves, (ii) der er ingen formodede GE eller GS sekvenser i udenlandske gen, og (iii) den fulde rekombinante genom følger de &…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke tidligere og nuværende medlemmer i laboratorier Drs. Peter Palese og Adolfo García-Sastre for udviklingen af NDV omvendt genetik teknikker og for teknisk assistance. Forskning i Newcastle disease-virus i AG-S laboratorium er delvist finansieret af niaD indrømme R01AI088770 og af Department of Homeland Security Science & Technology Center of Excellence for Emerging og zoonotiske Dyresygdomme (CEEZAD, tildeling nummer 2010-ST-061-AG001). Forskning i LM-S laboratorium er finansieret af NIH tilskud RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, NIAID Centers of Excellence for Influenza Forskning og overvågning (HHSN266200700008C) og University of Rochester Center for Biodefense Immun Modeling (HHSN272201000055C) .
DMEM | CORNING Cellgro | 10-013-CV | Any supplier |
OptiMEM | GIBCO | 31985-070 | |
Lipofectamine 2000 (LPF2000) | Invitrogen | 11668-019 | |
35% Bovine Albumin (BA) | Sigma | 232-936-2 | Any supplier |
Trypsin-EDTA | CORNING Cellgro | 25-052-CI | Any supplier |
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x | CORNING Cellgro | 30-002-CI | Any supplier |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | Any supplier |
Cell lines |