cDNAからの組換えニューカッスル病ウイルスのレスキュー

Summary

ニューカッスル病ウイルス（NDV）は広く、とりわけ、ワクチン接種および治療のための新たなベクターを開発するために、ここ数年で研究されてきた。これらの研究は、そのような私たちがここで説明しているようなcDNAから組換えウイルスを救出するための技術、することが可能となっている。

Abstract

ニューカッスル病ウイルス（NDV）、 パラミクソウイルス科 ¹のAvulavirus属のプロトタイプのメンバーは、非分節型マイナスセンス、一本鎖、ワクチン接種のためのベクターとしての潜在的な用途でRNAウイルス（図1）エンベロープとなるヒトの疾患の治療。これらのアプリケーションの詳細な調査は、cDNAを^2-5としての完全なゲノムをコードするプラスミドから組換えウイルスを救出する逆遺伝学技術の確立後に可能となった。ウイルスcDNAは、好都合には、ウイルスの遺伝子型を改変するおよび/ ​​または新たな転写単位を含むように、標準的なクローニング手順を用いて、in vitroで修飾することができる。このような遺伝的に修飾されたウイルスの救出は、感染の複数の段階に影響を与える要因を理解するための貴重なツールを提供だけでなく、抗原の発現および送達のためのベクターの開発と改善が可能に予防接種や治療のために。ここでは、組換えNDVsの救助のためのプロトコルを記述します。

Introduction

ニューカッスル病ウイルス（NDV）は、Avulavirus属 ¹に属する鳥類のパラミクソウイルスは、深刻な世界中の養鶏に影響を与える可能性があり、経済的に関係するので、広く研究さsurveilled人獣共通感染剤である。ていないヒトの病原体が、NDVも徹底的モデルパラミクソウイルスとして、その高度に興味深い、天然の腫瘍溶解特性⁶に両方の獣医分野を超えて研究されている。 NDVの研究は大幅に最初コンツェルマンおよびcoleagues ²によって狂犬病ウイルスについて記載された一本鎖の非セグメント化されたマイナスセンスRNAウイルスのための逆遺伝学技術の発展の恩恵を受けた。それらの野生型ゲノムの外来遺伝子又は改変を担持する遺伝的に改変されNDVsの様々な以来広く研究されている。これらの組換えウイルスとの連携がNDVのでなく、他の関連するHUMAだけでなく様々な病原性因子を特徴づけることが重要でしたN、インフルエンザウイルスなどの病原体⁷ -または緊急ニパウイルス^8。さらに、異なる多くの研究は、主にウイルスの免疫刺激特性を増強することにより、NDV ^6,9,10の生得的な抗腫瘍活性を改善するためのこれらの技術の使用を検討されている。組換えNDVs研究の他の関連する領域には、インフルエンザ^{5,11,12、HIV 13、}麻疹^14、SARSの¹⁵のような他のウイルス性疾患に対するワクチン候補の生成されたか、それは呼吸sincytialウイルス^（RSV）16によって引き起こされる。 NDVが提供する様々な注目すべき利点はヒト集団における既存の免疫の欠如である中で、外来遺伝子の挿入、recombinatory活性の欠如と全体的な前述の自然免疫刺激特性¹⁷と組み合わせて、高い安全性プロファイルの安定性。また、Pにおける組換え価のワクチンの使用の可能性は注目すべきだNDVと高病原性鳥インフルエンザウイルス^11,12の両方に対して防御oultry、。これは、このようにも人間に恐ろしい鳥インフルエンザの可能性間の特定のジャンプを防ぐために貢献し、家畜、野生から広がる、後者の可能性を減少させるための優れた方法があります。最後に、レポーターを発現するNDVは、先天性免疫応答の評価、ならびに複数のウイルスによってコードされるインターフェロン^18-27アンタゴニストの同定のために使用されてきた。

組換えのレスキュープロセスは、非分節、マイナス鎖RNAウイルスは基本的に人為的リボ核タンパク質又はRNPとして知られている最小の感染性分子機構（図2）をコードするcDNAをトランスフェクトすることによって産生細胞におけるウイルス複製サイクルを強制的に構成されている。 RNPは、ウイルスポリメラーゼ（PおよびLタンパク質）、核タンパク質（NP）およびウイルスの完全長ゲノムRNAで構成されています。このRNAは+アンチは番目ですまた、ウイルスRNPのタンパク質の他の部分と関連する、相補的なRNA-ゲノムの生成に必要なEテンプレートは、自然のウイルスは感染時の細胞の細胞質（図2Aにリリースするのと同じ感染複雑を再現）。以降、このステップからは、ウイルスサイクルが変更されたゲノムをキャプシド、自然と組換えビリオンを進めることができ、（図2B）が生成されます。驚くべきことに、代わりにゲノムcDNAのゲノムcDNAのトランスフェクションが大幅に損なわれるか、完全にレスキュー効率^2,28-30を廃止。ゲノムcDNAをトランスフェクトした場合であっても、トランスフェクトされた細胞内のRNPへの組換えRNAのキャプシド形成の効率は、おそらく非常に低い。このため、NDVのための救助プロトコルは、しばしば、許容細胞で、及び/又は、それらを共培養することにより、もともとトランスフェクトされた細胞から放出されたいくつかのウイルス粒子の増幅のための異なるステップを含む孵化鶏卵感染。

救助する前に、cDNAは、所望の改変を生成するために、標準的なクローニング手順により操作することができる。異なる遺伝子産物およびウイルスの調節配列の特異的変異が、率直にこの方法を実現することができるが、組換えNDVを含む公開された研究の多くは、NDVゲノムに新しい転写単位の添加を必要としてきた。パラミクソウイルス科の他のメンバーと同様に、NDVゲノムを差動ウイルスのライフサイクル¹のための重要な減少勾配での3 '末端に、その場所を尊重に応じて発現している6転写単位に、8つの異なるタンパク質をコードしている。このため、ゲノム内の新たな転写単位の位置を慎重にウイルス複製の導入遺伝子および障害の発現との間のバランスを達成するために選択されな​​ければならない。 PとM遺伝子との間の挿入はほとんど、tは使用されているハフ他のサイトにも^13,31をテストされています。

（I）NDVゲノムに含まれるべき、新たな遺伝子はウイルスRNA依存性RNAのための適切な信号の制御下にある必要があります：何であれ、挿入、NDV cDNAへのクローニングはrescuable構築物を作製するためにいくつかのルールに従う必要があるポリメラーゼ。これらの配列は、新たなオープンリーディングフレーム（ORF）の上流に添加されなければならないので、ポリメラーゼが単一のヌクレオチド配列の遺伝子間（IG）だけ離間し、前の遺伝子（GE）及び新たな導入遺伝子（GS）の先頭の端部を認識することができる。真核生物のリボソーム翻訳を改善するための有効なコザック（K）配列の付加も良く外来タンパク質発現の³²をお勧めします。NDVの（II）、効率的な複製、 パラミクソウイルス科のほとんどのメンバーについては、ゲノムの長さで、複数に依存している6 ^33しますので、NDVに任意の挿入は、この「6のルール」に従う必要があります。必要に応じて、REQ追加のヌクレオチドは新規ORFの下流に添加することができるuired、および（iii）導入遺伝子の配列は、レスキュー効率を損なう可能性配列、導入遺伝子発現および/またはウイルスのような生存可能なGEとGSを見つけるためにチェックされるべきである。存在する場合、これらの配列は、サイレント変異誘発により除去されなければならない。上記のルールに従う組換え完全長cDNAの生成が効率的に、ここで詳述したように、遺伝子組み換えNDVを生成するための最初のステップです。

システム内のすべてのDNA構築物は、T7 RNAポリメラーゼプロモーター（ 図3）の制御下にある。この細胞質ポリメラーゼは、組換え改変ワクシニアアンカラウイルス^{（MVA-T7）34}との同時感染によってトランスで提供されている。 図3（a）は、完全長ゲノムcDNA ^5をコードして^いる pNDV-B1プラスミドを示す。 図3Bは PTM1プラスミドは、NPをコードを示し、 PとLのORF。 、Uをコードしているプラ​​スミドのpCITE-GFP、T7プロモーター、緑色蛍光タンパク質（GFP）、およびニワトリβアクチンプロモーター³⁵の下で同じORFをコードするGFPのpCAGGS ¹⁸のnDer、対照として使用する。このプロトコルでは、レントジェニックNDV株のヒッチナーB1の⁵のcDNA（ 図4）から組換えNDVを救出する手順を示しています。

Protocol

1。哺乳動物細胞の作製（図4A、1日目） スプリットのHEp-2またはA549細胞を6ウェルプレート中のトランスフェクションの前日。細胞の密度は、翌日80〜90％のコンフルエンスに到達する必要があります。通常、コンフルエント100mmの皿（ウェル当たり1×10 6個程度）8ウェルに分割することができる。各ウイルスを救出するためには、2〜4の異なるウェルが含まれなけれ?…

Representative Results

NDVのレスキューは、日常的に、ウイルスの完全なcDNAへのアクセス権を持っている研究室で行われ、十分に確立された手順です。しかし、この方法の固有の確率論的な性質は、それが困難な100％の救済効率を達成することができる。プロセスの初期段階、特別にトランスフェクション効率およびMVA-T7の感染を監視し、潜在的な問題を特定するのに役立ちます。 図5（a）は成功した…

Discussion

いくつかの要因がNDVを救済しつつ、良好な結果を達成するために考慮されるべきである。最初に、使用する完全長cDNA構築物は、NDVゲノムへの新たな導入遺伝子/修飾の機能的組み込みを可能にするように設計される必要がある。上述したように、これは、手段、必要な場合は、（i）適切な遺伝子終結（GE）は、遺伝子間（IG）および遺伝子開始（GS）配列が追加されると、（ii）は、推定上のGE…

Materials

DMEM	CORNING Cellgro	10-013-CV	Any supplier
OptiMEM	GIBCO	31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019
35% Bovine Albumin (BA)	Sigma	232-936-2	Any supplier
Trypsin-EDTA	CORNING Cellgro	25-052-CI	Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x	CORNING Cellgro	30-002-CI	Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Any supplier
			Cell lines A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. Embryonated chicken eggs Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols. Turkey red blood cells (RBC) Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days. Plasmids Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography. Viruses The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures. Tissue culture media and solutions: DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C. 10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2•6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature. 1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4°C.