Rescate del virus de la enfermedad de Newcastle recombinante a partir de cDNA

Summary

Virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) se ha estudiado ampliamente en los últimos años con el fin de desarrollar nuevos vectores para la vacunación y la terapia, entre otros. Estos estudios han sido posible debido a las técnicas para rescatar virus recombinante a partir de cDNA, tales como las que se describen aquí.

Abstract

Virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), el miembro prototipo del género Avulavirus de la familia Paramyxoviridae ^1, es una, de sentido negativo no segmentado, de cadena única, envuelto ARN del virus (Figura 1) con aplicaciones potenciales como un vector para la vacunación y tratamiento de enfermedades humanas. Exploración en profundidad de estas aplicaciones sólo ha sido posible después de que el establecimiento de técnicas de genética inversa para rescatar a los virus recombinantes a partir de plásmidos que codifican sus genomas completos como cDNA ^2-5. ADNc viral puede ser convenientemente modificado in vitro mediante el uso de procedimientos de clonación estándar para alterar el genotipo del virus y / o para incluir nuevas unidades de transcripción. Rescate de estos virus modificados genéticamente proporciona una valiosa herramienta para entender los factores que afectan a múltiples etapas de la infección, así como permite el desarrollo y la mejora de los vectores para la expresión y entrega de antígenospara la vacunación y la terapia. Aquí se describe un protocolo para el rescate de NDVs recombinantes.

Introduction

Virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), un paramixovirus aviar perteneciente al género Avulavirus ^1, es un agente zoonótica económicamente relevante y por lo tanto ampliamente investigado y vigilado, que pueden afectar gravemente a la cría de aves en todo el mundo. Aunque no es un patógeno humano, NDV también se ha estudiado a fondo más allá del campo veterinario tanto como un modelo de paramixovirus y debido a sus propiedades altamente interesantes oncolíticos naturales, ^6. Investigación sobre el NDV se benefició en gran medida del desarrollo de técnicas de genética inversa para los virus de una sola cadena, no segmentados de sentido negativo de ARN, descrito por primera vez por el virus de la rabia por Conzelmann y coleagues ^2. Una variedad de NDVs modificados genéticamente con genes extraños o modificaciones de su tipo salvaje genoma se ha estudiado ampliamente desde entonces. Trabajar con estos virus recombinantes ha sido fundamental para caracterizar los diferentes factores de virulencia no sólo de NDV, sino también de otros huma relevanten patógenos, tales como virus de influenza A ⁷ – o la emergente Nipah virus ^8. Además, un número de diferentes estudios han explorado el uso de estas técnicas para mejorar la actividad antitumoral innata de NDV ^6,9,10, sobre todo mediante la mejora de las propiedades inmunoestimulantes del virus. Otro ámbito de investigación en NDVs recombinantes ha sido la generación de candidatos a vacunas contra otras enfermedades virales como la gripe ^{5,11,12, 13} VIH, sarampión ^{14, 15} SARS o la causada por el virus respiratorio sincytial (VRS) ^16. Entre las diversas ventajas notables prestados por NDV son la falta de inmunidad preexistente en la población humana, la estabilidad de los insertos extranjeros genéticos, la falta de actividad recombinatorios y en general un alto perfil de seguridad combinado con las propiedades inmunoestimulantes naturales antes mencionados ^17. También es digno de mención el uso potencial de las vacunas bivalentes recombinantes en poultry, la influenza aviar de protección tanto contra el NDV y altamente patógeno virus de ^11,12. Esto puede ser una excelente manera de reducir las posibilidades de que este último se diseminan desde silvestre a los animales domésticos, por lo que también ayuda a prevenir un posible salto inter-específica de la temida gripe aviar a los humanos. Por último, el reportero-expresando NDV se han utilizado para la evaluación de la respuesta inmune innata, así como la identificación de antagonista de interferón codificada por múltiples virus ^18-27.

El proceso de rescate de un recombinante, no segmentado, virus de ARN de cadena negativa consiste básicamente en forzar artificialmente un ciclo de replicación viral en una célula que produce mediante la transfección de ADNc que codifican la maquinaria molecular infecciosa mínima, conocida como ribonucleoproteína o RNP (Figura 2). Los RNPs consisten de la polimerasa viral (P y proteínas L), la nucleoproteína (NP) y de la longitud completa de ARN antigenómico del virus. Este ARN + antigenoma es the plantilla requerida para la generación de los genomas de ARN-complementarios, los cuales, también asociados con el resto de las proteínas de la RNP viral, recapitula el mismo complejo infecciosa que un virus natural sería liberar en el citoplasma de la célula después de la infección (Figura 2A ). A partir de este paso adelante, el ciclo viral puede proceder de forma natural y viriones recombinantes, encapsidadoras los genomas modificados, será generado (Figura 2B). Sorprendentemente, la transfección del ADNc genómico en lugar del cDNA antigenómico perjudica en gran medida o completamente suprime la eficiencia de rescate ^2,28-30. Incluso cuando se transfectó ADNc antigenómico, la eficiencia de la encapsidación del ARN recombinante en RNPs en células transfectadas es probablemente muy baja. Debido a esto, los protocolos de rescate para NDV a menudo incluyen diferentes pasos para la amplificación de las pocas partículas virales liberadas por las células transfectadas originalmente por cocultivo con células permisivas y / o por elinfección de huevos embrionados.

Antes de rescate, el ADNc se puede manipular por procedimientos de clonación estándar con el fin de generar las modificaciones deseadas. Mientras que las mutaciones específicas de los diferentes productos de los genes y las secuencias reguladoras del virus se pueden lograr sin rodeos esta manera, muchos de los trabajos publicados que involucran NDV recombinante ha requerido la adición de una nueva unidad de transcripción en el genoma de NDV. Al igual que otros miembros de la familia de los paramixovirus, el genoma de NDV codifica ocho proteínas diferentes en seis unidades de transcripción, que se expresan diferencialmente dependiendo de su ubicación respecto al extremo 3 'en un gradiente decreciente crítico para el ciclo de vida viral ^1. Debido a esto, la ubicación de la nueva unidad de transcripción dentro del genoma debe ser cuidadosamente seleccionado para lograr un equilibrio entre la expresión del transgén y el deterioro de la replicación viral. De inserción entre los genes P y M se ha utilizado la mayor parte, tHough otros sitios también se han probado ^13,31.

Cualquiera que sea la pieza de inserción, la clonación en ADNc de NDV tiene que seguir algunas reglas para generar un constructo rescatable: (i) cualquier nuevo gen que se incluirán en el genoma de NDV tiene que estar bajo control de las señales apropiadas para la viral dependiente de ARN-ARN polimerasa. Estas secuencias deben ser añadidos aguas arriba del nuevo marco de lectura abierto (ORF) de modo que la polimerasa puede reconocer el final del gen anterior (GE) y el comienzo de la nueva transgén (GS), separados por una sola secuencia de nucleótidos intergénica (IG) . También se recomienda la adición de un Kozak válida (K) de secuencia para mejorar la traducción eucariótica ribosómico para una mejor expresión de la proteína extranjera ^32; (ii) la replicación eficiente de NDV, como para la mayoría de los miembros de la familia Paramyxoviridae, es dependiente de la longitud del genoma de ser múltiplo de seis ^{de 33,} por lo tanto, cualquier inserción en el NDV tiene que seguir esta "regla de los seis". Si es necesario, se reqnucleótidos adicionales pedirá otra se pueden añadir aguas abajo de la ORF de nuevo, y (iii) la secuencia de transgén deben ser evaluados para encontrar posibles GE y GS como secuencias que puedan perjudicar la eficiencia del rescate, la expresión del transgen y / o la viabilidad del virus. Si está presente, estas secuencias deben ser removidos mediante mutagénesis silenciosa. La generación de ADNc de longitud completa recombinante siguiendo las reglas anteriormente mencionadas es la primera etapa con el fin de producir eficientemente un NDV genéticamente modificado como se detalla aquí.

En el sistema de todas las construcciones de ADN se encuentran bajo el control del promotor de T7 ARN polimerasa (Figura 3). Esta polimerasa citoplásmica se proporciona en trans por la coinfección con un vaccinia modificado Ankara del virus recombinante (MVA-T7) ^34. Figura 3A muestra el plásmido pNDV-B1, que codifica el ADNc de longitud completa antigenómico ^5. Figura 3B muestra los plásmidos pTM1 que codifica NP, ORFs P y L. Los plásmidos pCITE-GFP, que codifica, uajo el promotor T7, la proteína verde fluorescente (GFP), y pCAGGS GFP ^18, que codifica la misma ORF bajo el promotor de beta-actina de pollo ^35, se utilizan como controles. En este protocolo se muestra el procedimiento para rescatar NDV recombinante a partir del ADNc de la cepa lentogénica de NDV Hitchner B1 ⁵ (Figura 4).

Protocol

1. Preparación de células de mamíferos (Figura 4A, Día 1) Dividir HEp-2 o células A549 el día antes de la transfección en placas de 6 pocillos. Densidad de las células debe alcanzar el 80-90% de confluencia el día siguiente. Por lo general, un confluente 100 mm plato se puede dividir en 8 pozos (alrededor de 1 x 10 6 células por pocillo). Para cada virus para ser rescatado, 2-4 pozos diferentes deben incluirse, además de 2 pozos adicionales para los controles pCAGGS-GFP y…

Representative Results

Rescate de NDV es un procedimiento bien establecido, realizada de forma rutinaria en los laboratorios que tienen acceso a la ADNc completo del virus. Sin embargo, la naturaleza estocástica intrínseca del método hace que sea difícil de lograr la eficiencia de rescate 100%. El seguimiento de los primeros pasos del proceso, especialmente la eficacia de la transfección y la infección con MVA-T7, ayuda a la identificación de posibles problemas. Figura 5A muestra la transfección estándar y las eficie…

Discussion

Hay varios factores que deben ser considerados para lograr buenos resultados, mientras que el rescate de NDV. En primer lugar, la construcción de ADNc de longitud completa para ser utilizado tiene que ser diseñado para permitir la incorporación funcional de los nuevos transgenes / modificaciones en el genoma NDV. Esto significa que, como se ha dicho, que las secuencias de (i) de gama apropiada gen (GE), intergénica (IG) y el inicio del gen (GS) se deben añadir, si es necesario, (ii) no hay secuencias de GE o GS put…

Materials

DMEM	CORNING Cellgro	10-013-CV	Any supplier
OptiMEM	GIBCO	31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019
35% Bovine Albumin (BA)	Sigma	232-936-2	Any supplier
Trypsin-EDTA	CORNING Cellgro	25-052-CI	Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x	CORNING Cellgro	30-002-CI	Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Any supplier
			Cell lines A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. Embryonated chicken eggs Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols. Turkey red blood cells (RBC) Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days. Plasmids Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography. Viruses The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures. Tissue culture media and solutions: DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C. 10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2•6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature. 1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4°C.