Einzellige Mikroinjektions für Zellkommunikationsanalyse

Summary

Wir beschreiben hier, wie Sie eine Einzelzellmikroinjektion von Lucifer Yellow auszuführen einige nützliche Tipps zur Visualisierung zellulärer Kommunikation über Gap-Junctions in lebenden Zellen und liefern. Wir gehen davon aus, dass dieses Papier allen helfen wird, den Grad der zellulären Kopplung aufgrund funktioneller gap junctions zu bewerten. Alles, was hier beschrieben könnte im Prinzip angepasst anderen Fluoreszenzfarbstoffen mit einem Molekulargewicht unter 1000 Dalton.

Abstract

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

Introduction

Gap Junctions sind interzelluläre Kanäle, die die gegenseitige Verbindung zwischen benachbarten Zellen ¹ zu ermöglichen. Diese Kommunikation verbindet zwei oder mehr benachbarten Zellen, wo jeder trägt mit einem Connexin oder hemichannel den interzellulären Kanal zu bilden. In Säugerzellen wird das Connexon sechs Connexine, Monomere mit vier transmembranen Domänen und einer C- und N – terminalen im Zytoplasma ² gebildet. Gap Junctions erlauben nicht nur den Fluss von Ionen, sekundäre Botenstoffe und kleine Stoffwechselprodukte , sondern auch für viele Formen der zellulären Kommunikation in vielen physiologischen Prozessen, wie der synaptischen Übertragung, Herzkontraktion, Zellwachstum beitragen und Differenzierung ^{3, 4, 5, 6, 7, 8.} Zusätzlich Gap Junctions wurden mit den zugehörigenviele Krankheiten , darunter Krebs ^{9, 10,} Muskelatrophie ^11, einige genetische Krankheiten und demyelinisierenden Erkrankungen ^12.

Diese Art von interzellularen Übersprechens kann durch mehrere Methoden , ^{13, 14, 15, 16} ausgewertet werden. zur Visualisierung zellulärer Kommunikation über Gap-Junctions in lebenden Zellen in diesem Beitrag zeigen wir, wie ein Single-Cell-Mikroinjektion von Lucifer Yellow auszuführen. Wir diskutieren, wie die Zellen vorzubereiten und die Mikropipette, die Verwendung des Mikromanipulators und die Injektion von Lucifer Yellow-Farbstoff in einer Thymus-Epithel-Zelllinie. Normalerweise ist diese experimentelle Verfahren konnte durch den Durchschnitt der verbundenen Zellen zu der Zelle mit Farbstoff beladen analysiert werden. Darüber hinaus könnte dieses Verfahren mit anderen Fluoreszenzfarbstoffen mit einem Molekulargewicht unterhalb des Spaltes verwendet werdenKreuzungen Cut-off, die etwa 1000 Dalton ist.

Protocol

1. Herstellung von Zellen Pflegen einer Kultur eines Thymus – Epithel – Zelllinie (IT76M1) oder einer Zelle in einem Inkubator (37 ° C / 5% CO 2) getestet werden. Waschen Sie die Zellen mit PBS 1x (wiederholen Sie diesen Artikel 3x). Hinzufügen Trypsin zu den Zellen für 5 min. Hinzufügen Medium (zweimal des Volumens von Trypsin hinzugefügt in Punkt 1.3) mit 10% FBS (fötales Rinderserum) auf die Zellen mit Trypsin und zentrifugiert (800 × g für 5 min). </l…

Representative Results

Thymic epithelialen Zelllinie IT-76MI wurden verwendet Farbstoff Kopplung von gap junctions zu bewerten , da diese Zellen funktionelle Gap Junctions von 43 21 Connexin gebildet auszudrücken beschrieben wurden. Abbildung 1 zeigt die Injektion von Lucifer Yellow, wenn in der einen Zelle unterhalb der Spitze der Pipette aufgetragen. Nach einigen Minuten werden verbundenen Zellen fluoreszierend (Sternchen), die Diffusion des Fluoreszenzfarbstoffs durch die gap juncti…

Discussion

Um die Anwesenheit von funktionellen interzellularen gap junction, die Verwendung von Tracern , um zu überprüfen, die Membran undurchlässig sind, obwohl durchlässig durch interzelluläre Kanäle ¹⁶ erforderlich sind. Fluorescein, der erste Fluoreszenzfarbstoff von Zelle zu Zelle Kupplung ^22, durchlässig ist ³ zwischen nicht junctional Membranen zu beobachten und ist daher durch Lucifer Yellow Farbstoff ¹⁵ ersetzt wurde. …

Materials

Lucifer yellow	Sigma	L0259
Lithium Chloride	Sigma	L4408
PBS tablets	Sigma	P4417
RPMI	Sigma	R4130
Bovine fetal serum	Cultilab
Trypsin	Sigma	T4799
Microscope	Nikon	TE-2000	For microinjection experiments, one needs an inverted fluorescence microscope and filters for fluorescent microscopy
vibration-insulated table	Newport	VH3036W-OPT	A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage
Micromanipulator	Narishige	MMO-203	This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection.
Current Generator	Digitimer	DS2	To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations.