Nous décrivons ici comment effectuer une microinjection seule cellule de Lucifer Jaune pour visualiser la communication cellulaire via gap-jonctions dans les cellules vivantes, et de fournir quelques conseils utiles. Nous nous attendons à ce que ce document aidera tout le monde à évaluer le degré de couplage cellulaire en raison de jonctions lacunaires fonctionnels. Tout ce qui est décrit ici pourrait être, en principe, adapté à d'autres colorants fluorescents ayant un poids moléculaire inférieur à 1000 Daltons.
Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.
Les jonctions lacunaires sont des canaux intercellulaires qui permettent l'intercommunication entre les cellules voisines 1. Cette communication relie deux ou plusieurs cellules voisines, où chacun contribue avec un connexon ou hemichannel pour former le canal intercellulaire. Dans les cellules de mammifères, l'connexon est formé par six connexines, des monomères avec quatre domaines transmembranaires et un C et N terminaux dans le cytoplasme 2. Les jonctions lacunaires permettent non seulement le flux d'ions, les seconds messagers et de petits metabolites, mais contribuent également à de nombreuses formes de communication cellulaire dans de nombreux processus physiologiques, tels que la transmission synaptique, la contraction du coeur, la croissance et la différenciation cellulaire 3, 4, 5, 6, 7, 8. En outre jonctions lacunaires ont été associées àde nombreuses maladies telles que le cancer 9, 10, 11 l' atrophie musculaire, certaines maladies génétiques et des maladies démyélinisantes 12.
Ce type de diaphonie intercellulaire peut être évaluée par plusieurs méthodes 13, 14, 15, 16. Dans cet article, nous montrons comment effectuer une microinjection seule cellule de Lucifer Jaune pour visualiser la communication cellulaire via gap-jonctions dans les cellules vivantes. Nous discutons de la façon de préparer les cellules et la micropipette, l'utilisation du micromanipulateur et l'injection de Lucifer colorant jaune dans une lignée de cellules épithéliales du thymus. En général, cette procédure expérimentale pourrait être analysé par la moyenne des cellules connectées à la cellule chargée avec un colorant. En outre, ce procédé pourrait être utilisé avec d'autres colorants fluorescents ayant un poids moléculaire inférieur à l'écartjonctions de coupure qui est d'environ 1000 daltons.
Afin de vérifier la présence de intercellulaire fonctionnelle jonction lacunaire, l'utilisation de traceurs, qui sont membrane imperméable, bien perméable par des canaux intercellulaires sont nécessaires 16. Fluorescéine, le premier colorant fluorescent pour l' observation de cellule à cellule de couplage 22 est perméable entre les membranes non jonctionnels 3 et a par conséquent été remplacé par Lucifer Yellow …
The authors have nothing to disclose.
The authors dedicate this paper in honor of Prof. Gilberto Oliveira-Castro who introduced research in intercellular communication by gap junctions in Brazil. This work was funded by Capes, CNPQ and Faperj.
Lucifer yellow | Sigma | L0259 | |
Lithium Chloride | Sigma | L4408 | |
PBS tablets | Sigma | P4417 | |
RPMI | Sigma | R4130 | |
Bovine fetal serum | Cultilab | ||
Trypsin | Sigma | T4799 | |
Microscope | Nikon | TE-2000 | For microinjection experiments, one needs an inverted fluorescence microscope and filters for fluorescent microscopy |
vibration-insulated table | Newport | VH3036W-OPT | A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage |
Micromanipulator | Narishige | MMO-203 | This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection. |
Current Generator | Digitimer | DS2 | To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations. |