אנו מתארים כאן כיצד לבצע microinjection מתחיל מתא בודד הצהוב לוציפר לדמיין תקשורת סלולרית באמצעות-צומת פער בתאים חיים, ולספק כמה עצות שימושיות. אנו מצפים כי מסמך זה יעזור לכולם להעריך את מידת צימוד הסלולר בשל צומת פער פונקציונליים. הכל המתואר כאן יכול להיות, באופן עקרוני, מותאמי צבעי ניאון אחרים עם משקל מולקולרי להלן 1,000 Daltons.
Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.
צמתים הפער הם ערוצי אינטר המאפשרים אינטרקום בין תאים שכנים 1. תקשורת זו המחברת בין שני תאים או יותר השכנות, שבהן כל אחד תורם עם connexon או hemichannel כדי ליצור את ערוץ אינטר. בתאי יונקים, את connexon נוצר על ידי שישה connexins, מונומרים עם ארבעה תחומים הטרנסממברני ו- C ו- N מסוף בתוך הציטופלסמה 2. צמתים הפער לא רק לאפשר מעבר של יונים, שליחים משניים מטבוליטים קטנים, אלא גם לתרום הרבה צורות של תקשורת סלולרית בתהליכים פיזיולוגיים רבים, כגון העברה סינפטית, התכווצות הלב, צמיחת תאים ו -3 בידול, 4, 5, 6, 7, 8. בנוסף צומת פער נקשרומחלות רבות כולל סרטן 9, 10, ניוון שרירים 11, כמה מחלות גנטיות demyelinating 12 מחלות.
סוג זה של crosstalk בין תאית יכול להיות מוערך על ידי מספר שיטות 13, 14, 15, 16. במאמר זה, אנו מראים כיצד לבצע microinjection מתחיל מתא בודד הצהוב לוציפר לדמיין תקשורת סלולרית באמצעות-צומת פער בתאים חיים. אנו דנים כיצד להכין את התאים ואת micropipette, את השימוש של micromanipulator והזרמת לצבוע צהוב לוציפר בקו תא אפיתל הרתי. בדרך כלל, הליך ניסיוני זה יכול להיות מנותח על ידי הממוצע של תאי מחוברי התא טעון עם צבע. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש עם צבעי ניאון אחרים עם משקל מולקולרי מתחת הפערצומת חתוכים המהווה כ -1,000 Daltons.
כדי לאמת את הנוכחות של צומת הפער בין תאית פונקציונלי, להשתמש באמצעים, אשר קרום חדיר, למרות חדיר ידי ערוצי אינטר נדרשים 16. והעמסה, צבע פלואורסצנטי הראשון להבחין תא אל תא צימוד 22, הוא חדיר בין ממברנות הלא junctional 3 ו הוחלפה ולכן על ידי …
The authors have nothing to disclose.
The authors dedicate this paper in honor of Prof. Gilberto Oliveira-Castro who introduced research in intercellular communication by gap junctions in Brazil. This work was funded by Capes, CNPQ and Faperj.
Lucifer yellow | Sigma | L0259 | |
Lithium Chloride | Sigma | L4408 | |
PBS tablets | Sigma | P4417 | |
RPMI | Sigma | R4130 | |
Bovine fetal serum | Cultilab | ||
Trypsin | Sigma | T4799 | |
Microscope | Nikon | TE-2000 | For microinjection experiments, one needs an inverted fluorescence microscope and filters for fluorescent microscopy |
vibration-insulated table | Newport | VH3036W-OPT | A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage |
Micromanipulator | Narishige | MMO-203 | This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection. |
Current Generator | Digitimer | DS2 | To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations. |