La microinyección de una sola célula de Análisis de Comunicación Móvil

Summary

Se describe aquí cómo realizar una microinyección de una sola célula de Lucifer amarillo para visualizar la comunicación celular a través de las uniones gap-en las células vivas, y proporcionar algunos consejos útiles. Esperamos que este documento ayudará a cada uno para evaluar el grado de acoplamiento celular debido a uniones gap funcionales. Todo lo descrito aquí podría ser, en principio, adaptado a otros colorantes fluorescentes con peso molecular inferior a 1.000 Daltons.

Abstract

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

Introduction

Gap cruces son canales intercelulares que permiten la intercomunicación entre las células vecinas ^1. Esta comunicación se conecta dos o más células vecinas, donde cada uno contribuye con una conexón o hemicanal para formar el canal intercelular. En células de mamíferos, la conexón está formado por seis conexinas, monómeros con cuatro dominios transmembrana y una C y N terminal dentro del citoplasma ^2. Gap cruces no sólo permiten el flujo de iones, segundos mensajeros y pequeños metabolitos, sino que también contribuyen a muchas formas de comunicación celular en muchos procesos fisiológicos, tales como la transmisión sináptica, la contracción del corazón, el crecimiento y la diferenciación celular ^{3, 4, 5, 6, 7, 8.} Además las uniones comunicantes se han asociado conmuchas enfermedades incluyendo el cáncer de ^{9, 10,} atrofia muscular ^11, algunas enfermedades genéticas y enfermedades desmielinizantes ^12.

Este tipo de diafonía intercelular se puede evaluar mediante varios métodos ^{13, 14, 15, 16.} En este artículo se muestra cómo realizar una microinyección de una sola célula de Lucifer amarillo para visualizar la comunicación celular a través de las uniones gap-en las células vivas. Se discute cómo preparar las células y la micropipeta, el uso de la micromanipulador y la inyección de un colorante amarillo Lucifer en una línea de células epiteliales del timo. Por lo general, este procedimiento experimental podría ser analizado por el promedio de células conectadas a la célula de carga con colorante. Además, este método podría ser utilizado con otros colorantes fluorescentes con peso molecular por debajo de la brechauniones de corte que es de aproximadamente 1.000 daltons.

Protocol

1. Preparación de las células Mantener un cultivo de una línea celular epitelial del timo (IT76M1) o células a ensayar en una incubadora (37 ° C / 5% de CO 2). Se lavan las células con PBS 1x (repetir este artículo 3x). Añadir tripsina a las células durante 5 min. Añadir medio (dos veces del volumen de tripsina añadida en el punto 1.3) con 10% de FBS (suero bovino fetal) a las células con tripsina y se centrifuga (800 x g durante 5 min). Con…

Representative Results

Línea de células epiteliales del timo IT-76MI se utilizaron para evaluar tinte de acoplamiento por uniones comunicantes como se describen estas células para expresar uniones gap funcionales formados por conexinas 43 21. La Figura 1 muestra la inyección de Lucifer Yellow cuando se aplica en la célula debajo de la punta de la pipeta. Después de algunos minutos, las células se vuelven conectados fluorescente (asteriscos) que indica la difusión del colorante f…

Discussion

Con el fin de verificar la presencia de brecha de la salida intercelular funcional, el uso de trazadores, que son de la membrana impermeable, aunque permeable por canales intercelulares se requieren ^16. Fluoresceína, el primer tinte fluorescente para observar célula a célula de acoplamiento ^22, es permeable entre las membranas no de unión ³ y por lo tanto ha sido sustituido por Lucifer colorante amarillo ^15. En la actuali…

Materials

Lucifer yellow	Sigma	L0259
Lithium Chloride	Sigma	L4408
PBS tablets	Sigma	P4417
RPMI	Sigma	R4130
Bovine fetal serum	Cultilab
Trypsin	Sigma	T4799
Microscope	Nikon	TE-2000	For microinjection experiments, one needs an inverted fluorescence microscope and filters for fluorescent microscopy
vibration-insulated table	Newport	VH3036W-OPT	A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage
Micromanipulator	Narishige	MMO-203	This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection.
Current Generator	Digitimer	DS2	To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations.