Vi beskriver här hur man utför en enda cell mikroinjektion av Lucifer Yellow att visualisera cellulära kommunikation via gap-junctions i levande celler, och ger några användbara tips. Vi förväntar oss att detta dokument kommer att hjälpa alla att utvärdera graden av cellulär koppling på grund av funktionella gap-junctions. Allt som beskrivs här kan vara i princip anpassas till andra fluorescerande färgämnen med molekylvikt under 1000 Dalton.
Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.
Gap korsningar är inter kanaler som tillåter förbindelse bland angränsande celler 1. Detta meddelande förbinder två eller flera angränsande celler, där var och en bidrar med en connexon eller hemichannel att bilda inter kanal. I däggdjursceller, är connexon bildas av sex connexiner, monomerer med fyra transmembrandomäner och en C och N-terminala inom cytoplasman 2. Gap junctions inte bara tillåta flödet av joner, sekundära budbärare och små metaboliter, utan också bidra till många former av cellulär kommunikation i många fysiologiska processer, såsom synaptisk överföring, hjärtsammandragning, celltillväxt och differentiering 3, 4, 5, 6, 7, 8. Dessutom kanalförbindelser har associerats medmånga sjukdomar, bland annat cancer 9, 10, muskelatrofi 11, vissa genetiska sjukdomar och demyeliniserande sjukdomar 12.
Denna typ av intercellulär överhörning kan utvärderas genom flera metoder 13, 14, 15, 16. I detta dokument visar vi hur man utför en enkelcellmikroinjektion av Lucifer Yellow att visualisera cellulära kommunikation via gap-junctions i levande celler. Vi diskuterar hur man förbereder cellerna och mikropipett, användningen av mikromanipulator och injektion av Lucifer gult färgämne i en tymus epitelceller linje. Vanligtvis, kan detta försöksförfarande analyseras med genomsnittet av anslutna celler till cellen laddad med färgämne. Dessutom kan denna metod användas med andra fluorescerande färgämnen med molekylvikt under gapetkorsningar cut-off som är ca 1000 dalton.
För att kontrollera förekomsten av funktionella inter gap junction, användning av spårämnen, som är membran ogenomträngligt, men genomträngligt genom inter kanaler krävs 16. Fluorescein, den första fluorescerande färg för att observera cell-till-cell-koppling 22, är permeabel mellan icke junctionala membran 3 och har därför ersatts med Lucifer Yellow färgämne 15. För närvarande, för att hitta det bästa va…
The authors have nothing to disclose.
The authors dedicate this paper in honor of Prof. Gilberto Oliveira-Castro who introduced research in intercellular communication by gap junctions in Brazil. This work was funded by Capes, CNPQ and Faperj.
Lucifer yellow | Sigma | L0259 | |
Lithium Chloride | Sigma | L4408 | |
PBS tablets | Sigma | P4417 | |
RPMI | Sigma | R4130 | |
Bovine fetal serum | Cultilab | ||
Trypsin | Sigma | T4799 | |
Microscope | Nikon | TE-2000 | For microinjection experiments, one needs an inverted fluorescence microscope and filters for fluorescent microscopy |
vibration-insulated table | Newport | VH3036W-OPT | A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage |
Micromanipulator | Narishige | MMO-203 | This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection. |
Current Generator | Digitimer | DS2 | To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations. |