Analyse von Proteindynamik mit Wasserstoffwechsel Massenspektrometrie

Summary

Protein-Konformation und Dynamik sind der Schlüssel zum Verständnis der Beziehung zwischen Struktur und Funktion. Wasserstoffaustausch gekoppelt mit hochauflösender Massenspektrometrie ist eine vielseitige Methode, um die Konformationsänderungen Dynamik von Proteinen als auch studieren Charakterisierung von Protein-Ligand und Protein-Protein-Wechselwirkungen, einschließlich Kontaktschnittstellen und allosterische Effekte.

Abstract

Alle zellulären Prozesse abhängig von der Funktionalität der Proteine. Obwohl die Funktionalität eines gegebenen Proteins ist die direkte Folge der einzigartigen Aminosäuresequenz wird nur durch die Faltung der Polypeptidkette in einer einzigen definierten dreidimensionalen Anordnung oder häufiger in einem Ensemble von Konformationen ineinander Umwandeln realisiert. Die Untersuchung der Verbindung zwischen Protein-Konformation und seine Funktion ist für ein komplettes Verständnis davon, wie Proteine ​​in der Lage sind, ihre große Vielfalt von Aufgaben zu erfüllen daher unerlässlich. Eine Möglichkeit, ein Protein Konformationsänderungen erfährt, während voran durch seine Funktionszyklus studieren ^{Wasserstoff-1} H / ² H-Austausch in Kombination mit hochauflösender Massenspektrometrie (HX-MS). HX-MS ist eine vielseitige und robuste Methode, die eine neue Dimension der Strukturinformationen, zB durch Kristallographie gewonnen erstellt. Es wird verwendet, um Protein zu studieren und Ausklappen Bindung von kleinen molkül Liganden, Protein-Protein-Wechselwirkungen, Konformationsänderungen verbunden Enzymkatalyse und Allosterie. Zusätzlich wird HX-MS häufig verwendet, wenn die Menge an Protein ist sehr begrenzt oder Kristallisation des Proteins nicht möglich ist. Hier stellen wir ein allgemeines Protokoll für die Untersuchung der Proteindynamik mit HX-MS und zu beschreiben als ein Beispiel, wie man die Interaktionsschnittstelle von zwei Proteinen in einem Komplex zu offenbaren.

Introduction

Die Anzahl von Kristallstrukturen von Proteinen und Proteinkomplexen schnell erhöht in den letzten Jahren. Sie präsentieren unschätzbare Schnappschüsse von der strukturellen Organisation dieser Proteine ​​und eine Grundlage für die Struktur-Funktions-Analyse. Jedoch die Dynamik von Proteinen und Konformationsänderungen, die für ihre Funktionen sind, werden selten durch Röntgenkristallographie ergab. Cryo-Elektronenmikroskopie, auf der anderen Seite, ist in der Lage, Protein-und Protein-Komplexe in verschiedenen Konformationen zu erfassen, aber im Allgemeinen können Konformationsänderungen nicht lösen auf Sekundärstrukturebene ^ein. Konformationsdynamik von Proteinen in Lösung in atomarer Informationen sind nur für NMR gelöst werden, aber dieses Verfahren ist immer noch relativ kleine Proteine ​​von Größen (in der Regel ≤ 30 kDa) beschränkt und erfordert hohe Konzentrationen von Proteinen (≥ 100 &mgr; M), die Experimente mit behindert Oligomerisierung oder Aggregation neigen Proteine ^​​2. Eine Methode, dieder Lage ist, zwischen hochauflösende Röntgen-Kristallographie und Kryo-Elektronenmikroskopie und die Brücke nicht durch Größe oder Protein-Konzentration begrenzt ist ^{Amid-Wasserstoff-1} H / ² H-Austausch (HX) in Kombination mit der Massenspektrometrie (MS). In den letzten Jahren hat dieses Verfahren einen wertvollen analytisches Werkzeug für die Analyse von Proteindynamik, Proteinfaltung, der Proteinstabilität und Konformationsänderungen ^3-5 entwickelt. Die molekulare Grundlage dieses Verfahrens ist die Labilität Rückgrat Amidwasserstoffe in Proteinen, die durch Deuteriumatome austauscht, wenn das Protein in D ₂ O-Lösung gegeben. Die anschließende Erhöhung der Proteinmasse im Laufe der Zeit wird mit hochauflösenden MS gemessen.

Kurz unstrukturierten Peptiden HX hängt nur von der Temperatur, Katalysatorkonzentration (OH ^-, H ₃ O ^+, dh pH-Wert, siehe Abbildung 3) und Aminosäure-Seitenketten der benachbarten Resten durch induktive, Katzekatalytische und sterische Effekte. Diese Auswirkungen auf die intrinsische chemischen Austauschrate k _ch wurden elegant von Bai et al. ⁶ quantifiziert und ein Programm zur Verfügung (mit freundlicher Genehmigung Z. Zhang), die k _ch für jede Aminosäure in einem Polypeptid abhängig von pH-Wert und Temperatur berechnet. Bei neutralem pH-Wert und Umgebungstemperaturen _ch k in der Größenordnung von 10 ¹ bis 10 ³ sec ^-1. Ionen in das Innere einer eng gefalteten Protein ^– in gefalteter Proteine ​​HX 2-9 Größenordnungen langsamer hauptsächlich auf Wasserstoffbrückenbindung in der Sekundärstruktur und aufgrund eingeschränkter Zugangs hydratisierter OH geringem Ausmaß sein. HX in nativen Proteinen impliziert daher teilweise oder globale Entfaltung, chemischen Austausch und die Rückfaltung in den nativen Zustand nach Gleichung (1) und die beobachteten Wechselkurse k _obs abhängig von der Öffnungsrate k _op, die Schlussrate k _cl und der intrinsischen chemischen Austausch rate _ch k gemäß Gleichung (2).

Unter nativen Zustand Bedingungen k _op ist viel kleiner als k _ch und kann im Nenner vernachlässigt werden. Es gibt zwei extreme Wechsel Regime genannt EX1 und EX2. Wenn der k _Cl ist viel kleiner als k _CH (EX1) die beobachtete Geschwindigkeit praktisch gleich der Öffnungsrate und HX unmittelbare Beobachtung der Entfaltung eines Strukturelements. Ein solcher Austausch Regime, in dem alle Amidprotonen Austausch auf einmal beim Öffnen des Strukturelements ist leicht beobachtbaren MS durch eine bimodale Verteilung der Isotopenpeaks ^7. Wenn k _Cl ist viel größer als k _CH (EX2) die beobachtete Rate ist proportional zu k _ch wobei die Proportionalitätskonstante gleich dem Faltungs-Entfaltungs-Gleichgewichte ist die Konstante K _u = K _op </sub> K / _cl. Unter diesen Bedingungen sind viele Öffnungs-und Schließereignisse notwendig, bevor alle Amidprotonen gegen Deuteronen, was zu einem allmählichen Anstieg der Durchschnittsmasse, während die Isotopenverteilung etwa gleich bleibt. Die EX2 Regime ermöglicht die Bestimmung der freien Energie der Entfaltung &Dgr; G _u und damit der Stabilität eines Strukturelements. Unter nativen Zustand Zustand der EX2-Regime ist am häufigsten. Erhöhung des pH-Wertes und Zugabe von chaotropen Mitteln können die Austauschmechanismus zu EX1 verschieben. Daher kann HX-MS verwendet werden, um thermodynamische erkunden sowie kinetischen Parameter der Proteinfaltung und Konformationsänderungen werden.

Wie oben erwähnt ist HX eigen pH-und temperaturabhängig und der Austausch Halbwertszeit von einer völlig löse ausgesetzt Protonen des Rückgrats Amidgruppe zwischen 5-400 ms bei einem physiologischen pH-Wert (pH 7,6) und 30 ° C, aber mindestens 10 min auf> 15 Stunden mit einem Mittelwert von> 2 h bei pH 2,9 und 0 °C (mit Ausnahme des Protons des ersten Gerüst-Amidbindung eines Polypeptids, das mit einer Halbwertszeit von ca. 1-2 min austauscht). Unter solchen langsamen Austausch Bedingungen ist es möglich, die Probe zu verdauen Proteasen (z. B. Pepsin), die aktiv sind, unter diesen Bedingungen mit verlieren sich alle in den eingeDeuteRonen enthaltenen Informationen. Seit der Einführung des Magen-Darm-Verdauung unter langsamem Austausch Bedingungen kann nicht nur die Gesamt HX Kinetik der vollständigen Proteine ​​analysiert werden, aber HX kann auf bestimmte Regionen ^8,9 lokalisiert werden. Ortsauflösung wird noch auf die Größe der Fragmente Magen erzeugt, die im allgemeinen zwischen 10-30 Reste beschränkt. Jedoch könnte überlappende Fragmente aufgrund der unspezifischen Art der Spaltung durch Pepsin erzeugt eine Erhöhung der räumlichen Auflösung führen. Darüber hinaus wurden mehrere andere Proteasen gefunden unter Abschrecken Bedingungen aktiv zu sein, aber viel weniger effizient als Pepsin ^10. Weitere zunehse der räumlichen Auflösung können durch Fragmentierung von Peptiden in der Gasphase durch Methoden, die Deuterierung Muster wie Elektroneneinfang-Dissoziation (ECD), Elektronentransfer-Dissoziation (ETD) und Infrarot-Multiphoton-Dissoziation (IRMPD) ^11-13 erhaltenen erreichen. Diese Methoden verhindern den Verlust an räumlicher Auflösung durch intramolekulare Protonenwanderung ("Scrambling"), die durch stoßinduzierte Dissoziation (CID) zu beobachten ist die am häufigsten verwendeten Fragmentierungstechnik. Allerdings erfordern diese Verfahren die Optimierung für jedes einzelne Peptid und ist damit immer noch ziemlich schwierig.

HX-MS wurde verwendet, um Protein-Liganden und Protein-Protein-Wechselwirkungen, einschließlich virale Kapsid-Zusammensetzung ^14-17 analysieren. Protein-Entfaltung und Rückfaltung sowie temperaturinduzierte Konformationsänderung untersucht ^7,18,19. Phosphorylierung und einzigen Aminosäure mutationsbedingte Konformationsänderungen ^16,20 und nucleotide-induzierten Veränderungen wurden analysiert ^21,22. Daher scheint diese Methode ideal geeignet zur Montage und Dynamik von molekularen Maschinen zu analysieren. Ein attraktiver Kandidat, dessen Mechanismus ist von großem allgemeinem Interesse ist das Hsp90-Chaperon-Komplex.

Protocol

1. Herstellung von Puffern und Protein-Proben Bereiten H 2 O-Puffer. Verwendung Hsp90 Standardpuffer (40 mM HEPES / KOH, pH 7,5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 10% Glycerin) und H 2 O-Puffer. Hinweis: Wenn die Probe vor der Analyse dialysiert, verwenden Sie den Dialysepuffer als H 2 O-Puffer. Es ist wesentlich, daß die D 2 O-Puffer unterscheidet sich von der H 2 O-Puffer nur in der Wasserstoffisotop. Flüchtige Puffer wie NH <…

Representative Results

Hsp90 ist ein Chaperon in Hefe und Mitglied der Hsp90-Chaperon-Familie. Indem wir durch eine komplexe ATPase-Zyklus hilft es spät Klapptritt vieler Protein Kunden. Effiziente Faltung erfordert Transfer von Clients von Hsp70 und Wechselwirkung des Co-Chaperon Sti1/Hop. STI1 direkt bindet an Hsp90 und erleichtert die Client-Bindung durch die Hemmung von Hsp90-ATPase-Aktivität. Interaktion von Hsp90 mit STI1 wurde vor kurzem mit HX-MS-23 untersucht. Hier stellen wir repräsentative Ergebnisse der zugrunde lieg…

Discussion

Bindung eines Interaktionspartners zu einem Protein führt unweigerlich zu Veränderungen der Lösungsmittelzugänglichkeit an der Bindungsstelle. Darüber hinaus haben viele Proteine ​​werden dynamisch Konformationsänderungen bei der Bindung, die anderen Regionen beeinflussen als die tatsächliche Bindung Schnittstelle. HX-MS ist eine robuste Methode, um diese Änderungen zu überwachen und ist sogar in der Lage, enthüllt Konformationsänderungen in Proteinen auf Zeitskalen, dass andere Verfahren nicht abdecken k…

Materials

Reagent/Equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
maXis QTOF	Bruker
nanoAcquity UPLC	Waters Corp.
Shimadzu 10AD-VP	Shimadzu
6-port Valve EPC6W with microelectric actuator	Valco	#EPC6W
Injection valve (manual)	Rheodyne	#7725
Poros AL20 media	Applied Biosystems	#1-6029-06
Poros R2	Applied Biosystems	#1-1118-02
Pepsin	Sigma	#P6887	use fresh pepsin
Microbore (1 mm)	IDEX	#C-128
Microbore (2 mm)	IDEX	#C-130B
Acquity UPLC BEH C8 Column	Waters Corp.	#186002876
Thermomixer	Eppendorf	#5355000.011
Tubing (various diameters)	IDEX
Fittings	IDEX	#PK-110 with PK-100